Abstract When threatened by dangerous or harmful stimuli, animals engage in diverse forms of rapid escape behaviors. In Drosophila larvae, one type of escape response involves C-shaped bending and lateral rolling followed by rapid forward crawling. The sensory circuitry that promotes larval escape has been extensively characterized; however, the motor programs underlying rolling are unknown. Here, we characterize the neuromuscular basis of rolling escape behavior. We used high-speed, volumetric, Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (SCAPE) microscopy to image muscle activity during larval rolling. Unlike sequential peristaltic muscle contractions that progress from segment to segment during forward and backward crawling, the muscle activity progresses circumferentially during bending and rolling escape behavior. We propose that progression of muscular contraction around the larva’s circumference results in a transient misalignment between weight and the ground support forces, which generates a torque that induces stabilizing body rotation. Therefore, successive cycles of slight misalignment followed by reactive aligning rotation lead to continuous rolling motion. Supporting our biomechanical model, we found that disrupting the activity of muscle groups undergoing circumferential contraction progression lead to rolling defects. We use EM connectome data to identify premotor to motor connectivity patterns that could drive rolling behavior, and perform neural silencing approaches to demonstrate the crucial role of a group of glutamatergic premotor neurons in rolling. Our data reveal body-wide muscle activity patterns and putative premotor circuit organization for execution of the rolling escape response. Significance Statement To escape from dangerous stimuli, animals execute escape behaviors that are fundamentally different from normal locomotion. The rolling escape behavior of Drosophila larvae consists of C-shaped bending and rolling. However, the muscle contraction patterns that lead to rolling are poorly understood. We find that following the initial body bending, muscles contract in a circumferential wave around the larva as they enter the bend, maintaining unidirectional rolling that resembles cylinder rolling on a surface. We study the structure of motor circuits for rolling, inhibit different motor neurons to determine which muscles are essential for rolling, and propose circuit and biomechanical models for roll generation. Our findings provide insights into how motor circuits produce diverse motor behaviors.

Abstract The mechanisms specifying neuronal diversity are well-characterized, yet it remains unclear how or if these mechanisms regulate neural circuit assembly. To address this, we mapped the developmental origin of 160 interneurons from seven bilateral neural progenitors (neuroblasts), and identify them in a synapse-scale TEM reconstruction of the Drosophila larval CNS. We find that lineages concurrently build the sensory and motor neuropils by generating sensory and motor hemilineages in a Notch-dependent manner. Neurons in a hemilineage share common synaptic targeting within the neuropil, which is further refined based on neuronal temporal identity. Connectome analysis shows that hemilineage-temporal cohorts share common connectivity. Finally, we show that proximity alone cannot explain the observed connectivity structure, suggesting hemilineage/temporal identity confers an added layer of specificity. Thus, we demonstrate that the mechanisms specifying neuronal diversity also govern circuit formation and function, and that these principles are broadly applicable throughout the nervous system.

Abstract Animals can use a common set of muscles and motor neurons (MNs) to generate diverse locomotor behaviors, but how this is accomplished remains poorly understood. Previously, we characterized the muscle activity patterns for Drosophila larval forward and backward locomotion and found that ventral oblique (VO) muscles become active earlier in backward than in forward locomotion (Zarin et al. 2019). Here, we describe how premotor circuits generate differential activation timing of VO muscles. We identify inhibitory (A06c) and excitatory (A27h) premotor neurons (PMNs) with the greatest number of synapses with VO MNs. Strikingly, A06c is a bi-modal PMN that fires before and after VO MNs in forward locomotion but fires only after MNs in backward locomotion. Further, A27h is a forward-dedicated PMN active only in forward locomotion. These two PMNs interconnect with another forward-dedicated excitatory PMN (A18b3), to create feedforward inhibitory microcircuits that define the activity window for VO MNs/muscles, producing precise VO muscle patterns underlying forward locomotion. Silencing A06c, A27h, or A18b3 PMN results in premature VO muscle activation in forward locomotion, resembling early VO activation in backward locomotion. Our results identify PMN micro-circuits that produce unique MN/muscle activity patterns to create behavior-specific motor output.

Abstract Mapping the wired connectivity of a nervous system is a prerequisite for full understanding of function. In this respect, such endeavours can be likened to genome sequencing projects. These projects similarly produce impressive amounts of data which, whilst a technical tour-de-force , remain under-utilised without validation. Validation of neuron synaptic connectivity requires electrophysiology which has the necessary temporal and spatial resolution to map synaptic connectivity. However, this technique is not common and requires extensive equipment and training to master, particularly when applied to the small CNS of the Drosophila larva. Thus, validation of connectivity in this CNS has been more reliant on behavioural analyses and, in particular, activity imaging using the calcium-sensor GCaMP. Whilst both techniques are powerful, they each have significant limitations for this purpose. Here we use electrophysiology to validate an array of driver lines reported to label specific premotor interneurons that the Drosophila connectome project suggests are monosynaptically connected to an identified motoneuron termed the anterior corner cell (aCC). Our results validate this proposition for four selected lines. Thus, in addition to validating the connectome with respect to these four premotor interneurons, our study highlights the need to functionally validate driver lines prior to use.

Animals generate diverse motor behaviors, yet how the same motor neurons generate distinct behaviors remains an open question. Drosophila larvae have multiple behaviors, e.g. forward crawling, backward crawling, self-righting and escape, and all of the body wall motor neurons (MNs) driving these behaviors have been identified. Despite impressive progress in mapping larval motor circuits, the role of most motor neurons in locomotion remains untested, the majority of premotor neurons (PMNs) remain to be identified, and a full understanding of proprioceptor-PMN-MN connectivity is missing. Here we report a comprehensive larval proprioceptor-PMN-MN connectome; describe individual muscle/MN phase activity during both forward and backward locomotor behaviors; identify PMN-MN connectivity motifs that could generate muscle activity phase relationships, plus selected experimental validation; identify proprioceptor-PMN connectivity that provides an anatomical explanation for the role of proprioception in promoting locomotor velocity; and identify a new candidate escape motor circuit. Finally, we generate a recurrent network model that produces the observed sequence of motor activity, showing that the identified pool of premotor neurons is sufficient to generate two distinct larval behaviors. We conclude that different locomotor behaviors can be generated by a specific group of premotor neurons generating behavior-specific motor rhythms.

Command-like descending neurons can induce many behaviors, such as backward locomotion, escape, feeding, courtship, egg-laying, or grooming. In most animals it remains unknown how neural circuits switch between these antagonistic behaviors: via top-down activation/inhibition of antagonistic circuits or via reciprocal inhibition between antagonistic circuits. Here we use genetic screens, intersectional genetics, circuit reconstruction by electron microscopy, and functional optogenetics to identify a bilateral pair of larval “mooncrawler descending neurons” (MDNs) with command-like ability to coordinately induce backward locomotion and block forward locomotion; the former by activating a backward-specific premotor neuron, and the latter by disynaptic inhibition of a forward-specific premotor neuron. In contrast, direct reciprocal inhibition between forward and backward circuits was not observed. Thus, MDNs coordinate a transition between antagonistic larval locomotor behaviors. Interestingly, larval MDNs persist into adulthood, where they can trigger backward walking. Thus, MDNs induce backward locomotion in both limbless and limbed animals.