The nuclear envelope (NE) is a subdomain of the ER with prominent roles in nuclear organization, largely mediated by its distinctive protein composition. We developed methods to reveal novel, low abundance transmembrane (TM) proteins concentrated at the NE relative to the peripheral ER. Using label-free proteomics that compared isolated NEs to cytoplasmic membranes, we first identified proteins with apparent NE enrichment. In subsequent authentication, ectopically expressed candidates were analyzed by immunofluorescence microscopy to quantify their targeting to the NE in cultured cells. Ten proteins from a validation set were found to associate preferentially with the NE, including oxidoreductases, enzymes for lipid biosynthesis and regulators of cell growth and survival. We determined that one of the validated candidates, the palmitoyltransferase Zdhhc6, modifies the NE oxidoreductase Tmx4 and thereby modulates its NE levels. This provides a functional rationale for the NE concentration of Zdhhc6. Overall, our methodology has revealed a group of previously unrecognized proteins concentrated at the NE and additional candidates. Future analysis of these can potentially unveil new mechanistic pathways associated with the NE.

Abstract Emerin and LBR are abundant transmembrane proteins of the nuclear envelope (NE) that are concentrated at the inner nuclear membrane (INM). Although both proteins interact with chromatin and nuclear lamins, they have distinctive biochemical and functional properties. Here we have deployed proximity labeling using the engineered biotin ligase TurboID (TbID) and quantitative proteomics to compare the neighborhoods of emerin and LBR in cultured mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Our analysis revealed 232 high confidence proximity partners (HCPP) that interact selectively with emerin and/or LBR, 49 of which are shared by both. These included previously characterized NE-concentrated proteins, as well as a host of additional proteins not previously linked to emerin or LBR functions. Many of these are TM proteins of the ER and include two E3 ubiquitin ligases. Using the proximity ligation assay as an orthogonal approach, we validated the interactions described by proximity labeling for 11/12 proteins analyzed, supporting the robustness of our analysis. Overall, this work presents methodology that may be used for large-scale mapping of the landscape of the INM and reveals a group of new proteins with potential functional connections to emerin and LBR.