Abstract Most colorectal cancers (CRCs) develop from either adenomas (ADs) or sessile serrated lesions (SSLs). The origins and molecular landscapes of these histologically distinct pre-cancerous polyps remain incompletely understood. Here, we present an atlas at single-cell resolution of sporadic conventional tubular/tubulovillous ADs, SSLs, hyperplastic polyps (HPs), microsatellite stable (MSS) and unstable (MSI-H) CRC, and normal colonic mucosa. Using single-cell transcriptomics and multiplex imaging, we studied 69 datasets from 33 participants. We also examined separate sets of 66 and 274 polyps for RNA and targeted gene sequencing, respectively. We performed multiplex imaging on a tissue microarray of 14 ADs and 15 CRCs, and we integrated pre-cancer polyp data with published single-cell and The Cancer Genome Atlas (TCGA) bulk CRC data to establish potential polyp-cancer relationships. Striking differences were observed between ADs and SSLs that extended to MSS and MSI-H CRCs, respectively, reflecting their distinct origins and trajectories. ADs arose from WNT pathway dysregulation in stem cells, which aberrantly expanded and expressed a Hippo and ASCL2 regenerative program. In marked contrast, SSLs were depleted of stem cell-like populations and instead exhibited a program of gastric metaplasia in the setting of elevated cytotoxic inflammation. Using subtype-specific gene regulatory networks and shared genetic variant analysis, we implicated serrated polyps, including some HPs conventionally considered benign, as arising from a metaplastic program in committed absorptive cells. ADs and SSLs displayed distinct patterns of immune cell infiltration that may influence their natural history. Our multi-omic atlas provides novel insights into the malignant potential of colorectal polyps and serves as a framework for precision surveillance and prevention of sporadic CRC.

Colorectal cancer exhibits dynamic cellular and genetic heterogeneity during progression from precursor lesions toward malignancy. Leveraging spatial molecular information to construct a phylogeographic map of tumor evolution can reveal individualized growth trajectories with diagnostic and therapeutic potential. Integrative analysis of spatial multi-omic data from 31 colorectal specimens revealed simultaneous microenvironmental and clonal alterations as a function of progression. Copy number variation served to re-stratify microsatellite stable and unstable tumors into chromosomally unstable (CIN+) and hypermutated (HM) classes. Phylogeographical maps classified tumors by their evolutionary dynamics, and clonal regions were placed along a global pseudotemporal progression trajectory. Cell-state discovery from a single-cell cohort revealed recurring epithelial gene signatures and infiltrating immune states in spatial transcriptomics. Charting these states along progression pseudotime, we observed a transition to immune exclusion in CIN+ tumors as characterized by a novel gene expression signature comprised of DDR1, TGFBI, PAK4, and DPEP1 . We demonstrated how these genes and their protein products are key regulators of extracellular matrix components, are associated with lower cytotoxic immune infiltration, and show prognostic value in external cohorts. Through high-dimensional data integration, this atlas provides insights into co-evolution of tumors and their microenvironments, serving as a resource for stratification and targeted treatment of CRC.

Microbial influences on host cells depend upon the identities of the microbes, their spatial localization, and the responses they invoke on specific host cell populations. Multi-modal analyses of both microbes and host cells in a spatially-resolved fashion would enable studies into these complex interactions in native tissue environments, potentially in clinical specimens. While techniques to preserve each of the microbial and host cell compartments have been used to examine tissues and microbes separately, we endeavored to develop approaches to simultaneously analyze both compartments. Herein, we established an original method for mucus preservation using Poloxamer 407 (also known as Pluronic F-127), a thermoreversible polymer with mucus-adhesive characteristics. We demonstrate that this approach can preserve spatially-defined compartments of the mucus bi-layer in the colon and the bacterial communities within, compared with their marked absence when tissues were processed with traditional formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) pipelines. Additionally, antigens for antibody staining of host cells were preserved and signal intensity for 16S rRNA fluorescence in situ hybridization (FISH) was enhanced in Poloxamer-fixed samples. This in turn enabled us to integrate multi-modal analysis using a modified multiplex immunofluorescence (MxIF) protocol. Importantly, we have formulated Poloxamer 407 to polymerize and crosslink at room temperature for use in clinical workflows. These results suggest that the fixative formulation of Poloxamer 407 can be integrated into biospecimen collection pipelines for simultaneous analysis of microbes and host cells.### Competing Interest StatementCLS receives research funding from Bristol Myers Squibb and Janssen and a personal fee from Merck & Co. in 2019 for an advisory role. The authors declare that there are no other competing interests.