Background Whether long-term suppression of replication of hepatitis B virus (HBV) has any beneficial effect on regression of advanced liver fibrosis associated with chronic HBV infection remains unclear. We aimed to assess the effects on fibrosis and cirrhosis of at least 5 years' treatment with tenofovir disoproxil fumarate (DF) in chronic HBV infection. Methods After 48 weeks of randomised double-blind comparison (trials NCT00117676 and NCT00116805) of tenofovir DF with adefovir dipivoxil, participants (positive or negative for HBeAg) were eligible to enter a 7-year study of open-label tenofovir DF treatment, with a pre-specified repeat liver biopsy at week 240. We assessed histological improvement (≥2 point reduction in Knodell necroinflammatory score with no worsening of fibrosis) and regression of fibrosis (≥1 unit decrease by Ishak scoring system). Findings Of 641 patients who received randomised treatment, 585 (91%) entered the open-label phase, and 489 (76%) completed 240 weeks. 348 patients (54%) had biopsy results at both baseline and week 240. 304 (87%) of the 348 had histological improvement, and 176 (51%) had regression of fibrosis at week 240 (p<0·0001). Of the 96 (28%) patients with cirrhosis (Ishak score 5 or 6) at baseline, 71 (74%) no longer had cirrhosis (≥1 unit decrease in score), whereas three of 252 patients without cirrhosis at baseline progressed to cirrhosis at year 5 (p<0·0001). Virological breakthrough occurred infrequently and was not due to resistance to tenofovir DF. The safety profile was favourable: 91 (16%) patients had adverse events but only nine patients had serious events related to the study drug. Interpretation In patients with chronic HBV infection, up to 5 years of treatment with tenofovir DF was safe and effective. Long-term suppression of HBV can lead to regression of fibrosis and cirrhosis. Funding Gilead Sciences.

Stromal cells can have a significant impact on the carcinogenic process in adjacent epithelia. The role of transforming growth factor–β (TGF-β) signaling in such epithelial-mesenchymal interactions was determined by conditional inactivation of the TGF-β type II receptor gene in mouse fibroblasts ( Tgfbr2 fspKO ). The loss of TGF-β responsiveness in fibroblasts resulted in intraepithelial neoplasia in prostate and invasive squamous cell carcinoma of the forestomach, both associated with an increased abundance of stromal cells. Activation of paracrine hepatocyte growth factor (HGF) signaling was identified as one possible mechanism for stimulation of epithelial proliferation. Thus, TGF-β signaling in fibroblasts modulates the growth and oncogenic potential of adjacent epithelia in selected tissues.

Tenofovir disoproxil fumarate (DF) is a nucleotide analogue and a potent inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and hepatitis B virus (HBV) polymerase.

Gastric cancer is the fifth most frequently diagnosed cancer and the third leading cause of death from cancer in the world. Several advances have been made in the staging procedures, imaging techniques, and treatment approaches. The NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines) for Gastric Cancer provide an evidence- and consensus-based treatment approach for the management of patients with gastric cancer. This manuscript discusses the recommendations outlined in the NCCN Guidelines for staging, assessment of HER2 overexpression, systemic therapy for locally advanced or metastatic disease, and best supportive care for the prevention and management of symptoms due to advanced disease.

Background & Aims: Increased inflammatory cytokine levels and intestinal epithelial cell apoptosis leading to disruption of epithelial integrity are major pathologic factors in inflammatory bowel diseases. The probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and factors recovered from LGG broth culture supernatant (LGG-s) prevent cytokine-induced apoptosis in human and mouse intestinal epithelial cells by regulating signaling pathways. Here, we purify and characterize 2 secreted LGG proteins that regulate intestinal epithelial cell antiapoptotic and proliferation responses. Methods: LGG proteins were purified from LGG-s, analyzed, and used to generate polyclonal antibodies for immunodepletion of respective proteins from LGG-conditioned cell culture media (CM). Mouse colon epithelial cells and cultured colon explants were treated with purified proteins in the absence or presence of tumor necrosis factor (TNF). Akt activation, proliferation, tissue injury, apoptosis, and caspase-3 activation were determined. Results: We purified 2 novel proteins, p75 (75 kilodaltons) and p40 (40 kilodaltons), from LGG-s. Each of these purified protein preparations activated Akt, inhibited cytokine-induced epithelial cell apoptosis, and promoted cell growth in human and mouse colon epithelial cells and cultured mouse colon explants. TNF-induced colon epithelial damage was significantly reduced by p75 and p40. Immunodepletion of p75 and p40 from LGG-CM reversed LGG-CM activation of Akt and its inhibitory effects on cytokine-induced apoptosis and loss of intestinal epithelial cells. Conclusions: p75 and p40 are the first probiotic bacterial proteins demonstrated to promote intestinal epithelial homeostasis through specific signaling pathways. These findings suggest that probiotic bacterial components may be useful for preventing cytokine-mediated gastrointestinal diseases. Background & Aims: Increased inflammatory cytokine levels and intestinal epithelial cell apoptosis leading to disruption of epithelial integrity are major pathologic factors in inflammatory bowel diseases. The probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and factors recovered from LGG broth culture supernatant (LGG-s) prevent cytokine-induced apoptosis in human and mouse intestinal epithelial cells by regulating signaling pathways. Here, we purify and characterize 2 secreted LGG proteins that regulate intestinal epithelial cell antiapoptotic and proliferation responses. Methods: LGG proteins were purified from LGG-s, analyzed, and used to generate polyclonal antibodies for immunodepletion of respective proteins from LGG-conditioned cell culture media (CM). Mouse colon epithelial cells and cultured colon explants were treated with purified proteins in the absence or presence of tumor necrosis factor (TNF). Akt activation, proliferation, tissue injury, apoptosis, and caspase-3 activation were determined. Results: We purified 2 novel proteins, p75 (75 kilodaltons) and p40 (40 kilodaltons), from LGG-s. Each of these purified protein preparations activated Akt, inhibited cytokine-induced epithelial cell apoptosis, and promoted cell growth in human and mouse colon epithelial cells and cultured mouse colon explants. TNF-induced colon epithelial damage was significantly reduced by p75 and p40. Immunodepletion of p75 and p40 from LGG-CM reversed LGG-CM activation of Akt and its inhibitory effects on cytokine-induced apoptosis and loss of intestinal epithelial cells. Conclusions: p75 and p40 are the first probiotic bacterial proteins demonstrated to promote intestinal epithelial homeostasis through specific signaling pathways. These findings suggest that probiotic bacterial components may be useful for preventing cytokine-mediated gastrointestinal diseases. Inflammatory bowel diseases (IBD) are characterized by increased production of inflammatory cytokines, epithelial cell apoptosis, and immune cell infiltration, leading to disruption of the intestinal epithelial integrity.1Sartor R.B. Mucosal immunology and mechanisms of gastrointestinal inflammation.in: Feldman M. Friedman L.S. Sleisenger M.H. 7th ed. Sleisenger & Fordtran’s gastrointestinal and liver disease: pathophysiology, diagnosis, management. Volume I. Saunders, Philadelphia2002: 21-51Google Scholar Therefore, remission of these disorders requires both decreased apoptosis and restitution of the damaged epithelium. Recent studies reveal several potential therapeutic approaches to induce restitution of the damaged epithelium. Growth factors2El-Assal O.N. Besner G.E. HB-EGF enhances restitution after intestinal ischemia/reperfusion via PI3K/Akt and MEK/ERK1/2 activation.Gastroenterology. 2005; 129: 609-625Google Scholar, 3Matsuura M. Okazaki K. Nishio A. Nakase H. Tamaki H. Uchida K. Nishi T. Asada M. Kawasaki K. Fukui T. Yoshizawa H. Ohashi S. Inoue S. Kawanami C. Hiai H. Tabata Y. Chiba T. Therapeutic effects of rectal administration of basic fibroblast growth factor on experimental murine colitis.Gastroenterology. 2005; 128: 975-986Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (65) Google Scholar, 4McCole D.F. Rogler G. Varki N. Barrett K.E. Epidermal growth factor partially restores colonic ion transport responses in mouse models of chronic colitis.Gastroenterology. 2005; 129: 591-608Crossref Scopus (54) Google Scholar, 5Sinha A. Nightingale J. West K.P. Berlanga-Acosta J. Playford R.J. Epidermal growth factor enemas with oral mesalamine for mild-to-moderate left-sided ulcerative colitis or proctitis.N Engl J Med. 2003; 349: 350-357Google Scholar and cytokines6Marini M. Bamias G. Rivera-Nieves J. Moskaluk C.A. Hoang S.B. Ross W.G. Pizarro T.T. Cominelli F. TNF-α neutralization ameliorates the severity of murine Crohn’s-like ileitis by abrogation of intestinal epithelial cell apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 8366-8371Google Scholar, 7Zeissig S. Bojarski C. Buergel N. Mankertz J. Zeitz M. Fromm M. Schulzke J.D. Down-regulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn’s disease by tumor necrosis factor α antibody treatment.Gut. 2004; 53: 1295-1302Google Scholar have been reported to modulate these processes by regulating proliferation,3Matsuura M. Okazaki K. Nishio A. Nakase H. Tamaki H. Uchida K. Nishi T. Asada M. Kawasaki K. Fukui T. Yoshizawa H. Ohashi S. Inoue S. Kawanami C. Hiai H. Tabata Y. Chiba T. Therapeutic effects of rectal administration of basic fibroblast growth factor on experimental murine colitis.Gastroenterology. 2005; 128: 975-986Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (65) Google Scholar migration,2El-Assal O.N. Besner G.E. HB-EGF enhances restitution after intestinal ischemia/reperfusion via PI3K/Akt and MEK/ERK1/2 activation.Gastroenterology. 2005; 129: 609-625Google Scholar and apoptosis.6Marini M. Bamias G. Rivera-Nieves J. Moskaluk C.A. Hoang S.B. Ross W.G. Pizarro T.T. Cominelli F. TNF-α neutralization ameliorates the severity of murine Crohn’s-like ileitis by abrogation of intestinal epithelial cell apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 8366-8371Google Scholar, 7Zeissig S. Bojarski C. Buergel N. Mankertz J. Zeitz M. Fromm M. Schulzke J.D. Down-regulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn’s disease by tumor necrosis factor α antibody treatment.Gut. 2004; 53: 1295-1302Google Scholar Increasing evidence suggests that some commensal bacteria enhance intestinal epithelial homeostasis and barrier integrity. Indeed, commensal bacteria regulate a number of host processes, including nutrition, development, and immune responses, that are relevant for both health and disease.8Yan F. Polk D.B. Commensal bacteria in the gut: learning who our friends are.Curr Opin Gastroenterol. 2004; 20: 565-571Google Scholar Therefore, manipulation of intestinal bacterial flora has been used as an alternative health approach for disease prevention and treatment.9Sartor R.B. Therapeutic manipulation of the enteric microflora in inflammatory bowel diseases: antibiotics, probiotics, and prebiotics.Gastroenterology. 2004; 126: 1620-1633Google Scholar Living microorganisms in the intestinal tract that benefit the host are termed probiotics.10Lilly D.M. Stillwell R.H. Probiotics: Growth-promoting factors produced by microorganisms.Science. 1965; 147: 747-748Google Scholar Recent studies indicate that some Lactobacillus species function as probiotics and induce sustained remission in ulcerative colitis and pouchitis.11Borody T.J. Warren E.F. Leis S. Surace R. Ashman O. Treatment of ulcerative colitis using fecal bacteriotherapy.J Clin Gastroenterol. 2003; 37: 42-47Google Scholar, 12Dieleman L.A. Goerres M.S. Arends A. Sprengers D. Torrice C. Hoentjen F. Grenther W.B. Sartor R.B. Lactobacillus GG prevents recurrence of colitis in HLA-B27 transgenic rats after antibiotic treatment.Gut. 2003; 52: 370-376Google Scholar, 13Mimura T. Rizzello F. Helwig U. Poggioli G. Schreiber S. Talbot I.C. Nicholls R.J. Gionchetti P. Campieri M. Kamm M.A. Once daily high dose probiotic therapy (VSL#3) for maintaining remission in recurrent or refractory pouchitis.Gut. 2004; 53: 108-114Google Scholar, 14Schultz M. Timmer A. Herfarth H.H. Sartor R.B. Vanderhoof J.A. Rath H.C. Lactobacillus GG in inducing and maintaining remission of Crohn’s disease.BMC Gastroenterol. 2004; 4: 5Google ScholarLactobacillus rhamnosus GG (LGG), a bacterium used in the production of yogurt, is one of the best-studied Lactobacillus strains in clinical trials for IBD. The presumed first target of probiotic actions is the intestinal epithelial cell. Probiotic bacteria stimulate several intestinal epithelial cell protective responses, including enhancement of epithelial barrier function,15Resta-Lenert S. Barrett K.E. Live probiotics protect intestinal epithelial cells from the effects of infection with enteroinvasive Escherichia coli (EIEC).Gut. 2003; 52: 988-997Google Scholar, 16Resta-Lenert S. Barrett K.E. Probiotics and commensals reverse TNF-α- and IFN-γ-induced dysfunction in human intestinal epithelial cells.Gastroenterology. 2006; 130: 731-746Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (243) Google Scholar mucin synthesis and secretion,17Mack D.R. Ahrne S. Hyde L. Wei S. Hollingsworth M.A. Extracellular MUC3 mucin secretion follows adherence of Lactobacillus strains to intestinal epithelial cells in vitro.Gut. 2003; 52: 827-833Google Scholar, 18Otte J.M. Podolsky D.K. Functional modulation of enterocytes by gram-positive and gram-negative microorganisms.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004; 286: G613-G626Google Scholar inhibition of enteropathogenic Echerichia coli binding,17Mack D.R. Ahrne S. Hyde L. Wei S. Hollingsworth M.A. Extracellular MUC3 mucin secretion follows adherence of Lactobacillus strains to intestinal epithelial cells in vitro.Gut. 2003; 52: 827-833Google Scholar and cell survival.19Yan F. Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells.J Biol Chem. 2002; 277: 50959-50965Google Scholar However, the mechanisms regulating epithelial responses to probiotics are complex and mostly unknown. We have used LGG to investigate molecular mechanisms by which probiotics regulate intestinal epithelial cells. We previously reported that LGG prevents cytokine-induced apoptosis in both human and mouse intestinal epithelial cells through activating Akt and inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation.19Yan F. Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells.J Biol Chem. 2002; 277: 50959-50965Google Scholar Akt plays a central role in promoting cell survival by inactivation of several proapoptotic pathways, including Bad, caspase 9, and caspase 3, and stimulating cell proliferation by activation of cell cycle regulators, such as cyclin/cyclin-dependent kinase (CDK).20Amaravadi R. Thompson C.B. The survival kinases Akt and Pim as potential pharmacological targets.J Clin Invest. 2005; 115: 2618-2624Google Scholar, 21Hanada M. Feng J. Hemmings B.A. Structure, regulation and function of PKB/AKT—a major therapeutic target.Biochim Biophys Acta. 2004; 1697: 3-16Google Scholar We further found that soluble factors recovered from LGG broth culture supernatant (LGG-s) activate Akt in a phosphatidylinositol-3′-kinase (PI3K)-dependent manner and prevent cytokine-mediated apoptosis.19Yan F. Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells.J Biol Chem. 2002; 277: 50959-50965Google Scholar One recent report has shown that soluble factors present in LGG-s induce cytoprotective heat shock protein synthesis in intestinal epithelial cells.22Tao Y. Drabik K.A. Waypa T.S. Musch M.W. Alverdy J.C. Schneewind O. Chang E.B. Petrof E.O. Soluble factors from Lactobacillus GG activate MAPKs and induce cytoprotective heat shock proteins in intestinal epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol. 2006; 290: C1018-C1030Google Scholar However, to our knowledge, the specific components of LGG-s that promote intestinal epithelial health have not been identified. Therefore, the purpose of this study was to purify and characterize LGG-derived soluble proteins that regulate intestinal epithelial cell proliferation and survival. Here, we report that 2 proteins (p75 and p40) purified from LGG-s stimulate Akt activation, promote cell growth, and inhibit tumor necrosis factor (TNF)-induced epithelial cell apoptosis in cultured cells and ex vivo colon organ culture models. Furthermore, although a number of Lactobacilli display antiapoptotic activity when in contact with epithelial cells, only those strains producing soluble p75 and p40 conferred this response in the absence of cell contact. The present studies provide novel insight into the molecular mechanisms of probiotic regulation of intestinal epithelial cells. These findings suggest that it may be possible to use probiotic bacterial products for gastrointestinal disease prevention and treatment. Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103), Lactobacillus casei 334, (ATCC 334), Lactobacillus casei 393 (ATCC 393), and Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356) were cultured in Lactobacillus MRS broth at 37°C19Yan F. Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells.J Biol Chem. 2002; 277: 50959-50965Google Scholar, 23Miettinen M. Vuopio-Varkila J. Varkila K. Production of human tumor necrosis factor α, interleukin-6, and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria.Infect Immun. 1996; 64: 5403-5405Crossref Google Scholar according to ATCC guidelines. Bacteria were harvested from MRS broth by centrifugation and washed twice with phosphate-buffered saline (PBS). Following centrifugation, LGG-s was passed through a 0.2-μm filter. LGG-conditioned cell culture media (LGG-CM) were generated by incubating LGG (107colony-forming units (CFU)/mL) in RPMI or Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) cell culture medium at 37°C for 2 hours; the media were then centrifuged twice, and the supernatant was filtered (0.2 μm). To purify proteins under native conditions from LGG-s, LGG-s was loaded onto UNOsphere S ion exchange media (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), which was prepared according to the manufacturer’s instructions. Bound proteins were eluted using 30 mmol/L Tris, pH 7.3, containing sequential concentrations of NaCl (100 to 800 mmol/L). Eluted fractions were collected and subjected to SDS-PAGE and stained with Colloidal Blue Stain kit (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Eluted fractions containing proteins were then concentrated using Amicon Ultra-4 centrifugal filter devices (Millipore, Bedford, MA), with a 5-kilodalton molecular weight limit cut-off, and the >5-kilodalton molecular weight fraction was retained for study. Protein concentrations were determined by using a DC protein assay (Bio-Rad Laboratories). From 200 mL of LGG broth culture (107Zeissig S. Bojarski C. Buergel N. Mankertz J. Zeitz M. Fromm M. Schulzke J.D. Down-regulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn’s disease by tumor necrosis factor α antibody treatment.Gut. 2004; 53: 1295-1302Google Scholar CFU/mL), approximately 1 mg of p40 and 0.75 mg of p75 were purified. The concentration of purified proteins was adjusted to 0.1 mg/mL using PBS. To prepare p75 and p40 as antigens for generating antibodies, chromatographically purified p75 and p40 were separated on an SDS-PAGE gel, and p75 and p40 bands were excised and electroeluted from the gels using a Model 422 Electro-Eluter (Bio-Rad Laboratories) according to the manufacturer’s instructions. SDS in the eluted fractions was removed by Bio-Beads SM-2 adsorbents (Bio-Rad Laboratories). Polyclonal antibodies against p75 and p40 were generated by injecting rabbits with purified p75 or p40 proteins, respectively (Strategic Biosolutions, Newark, DE). p75 and p40 Antibodies were conjugated to Protein A/G beads (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) by incubating antibodies with beads in PBS for 2 hours at 4°C. To sequentially immunodeplete p75 and p40 from LGG-CM, LGG-CM was incubated with anti-p75 antibody-conjugated beads for 4 hours at 4°C. After removing anti-p75 antibody-conjugated beads, CM was incubated with anti-p40 antibody-conjugated beads for another 4 hours. Preimmune serum was used as the negative control. The amounts of p75 and p40 present in LGG-CM or immunodepleted LGG-CM were detected by Western blot analysis with anti-p75 and anti-p40 antibodies. p75 and p40 Proteins were purified as described previously, separated by SDS-PAGE, and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad Laboratories, Inc). N-terminal peptide sequence analysis of p75 and p40 by the Edman degradation methodology was performed at the Iowa State University Protein Facility (Ames, IA). Internal peptide sequences of p75 and p40 were determined by performing in-gel digestion of the proteins with trypsin, followed by analysis of the resulting peptides by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), time-of-flight (TOF) tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/MS/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) at the Vanderbilt University Proteomics Core of the Digestive Disease Research Center, Nashville, TN. N-terminal and internal peptide sequences of p75 and p40 were compared with protein sequences in the NCBI microbial genome database using BLAST analysis. The most closely related proteins were encoded by 2 genes in the genome of Lactobacillus casei 334 (Genbank accession numbers COG0791 and COG3883 ). Multiple primer pairs were designed based on the sequences of these L casei genes and flanking DNA sequences in the L casei genome. LGG genomic DNA was isolated using the Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Madison, WI), and this DNA was used as a template for polymerase chain reaction (PCR). PCR was carried out for 30 cycles, each including 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 55°C, and 30 seconds at 72°C. PCR products were excised from agarose gels and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Company, Valencia, CA). PCR products were cloned into pGEM-T Easy vector (Promega Corporation), plasmids were transformed into E coli DH5α, and nucleotide sequences were then determined. Young adult mouse colon (YAMC) epithelial cells or kinase suppressor of Ras−1 knockout (KSRI−/−) mouse colon epithelial (MCE) cells were maintained in RPMI 1640 media with 5% fetal bovine serum (FBS) and 5 U/mL of murine interferon (IFN)-γ on collagen-coated plates and grown under permissive conditions at 33°C with 5% CO2.24Yan F. John S.K. Wilson G. Jones D.S. Washington M.K. Polk D.B. Kinase suppressor of Ras protects intestinal epithelium from cytokine-mediated apoptosis during inflammation.J Clin Invest. 2004; 114: 1272-1280Google Scholar Before all experiments, cells were transferred to 37°C (nonpermissive) conditions with 0.5% FBS, IFN-γ-free media for 16 hours. The human colonic epithelial carcinoma cell line, HT 29 cells, was grown in DMEM media supplemented with 10% FBS at 37°C. Cells were serum starved (0.5%) at 37°C for approximately 16 hours before experiments. Cells were treated with purified p75, p40, LGG-CM, or 107 CFU/mL of bacteria (20:1 ratio of bacteria to cells) for 2 hours or 1 hour before TNF (100 ng/mL) treatment. To compare the effects of soluble factors, cells were cultured in transwells with bacteria placed in the upper chamber, separated by a permeable filter (0.2 μm pore size). After treatment, cell monolayers were washed twice with ice-cold PBS and then scraped into cell lysis buffer (20 mmol/L HEPES [pH 7.5], 1 mmol/L orthovandate, 50 mmol/L β-glycerolphosphate, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, with leupeptin [10 μg/mL], aprotinin [10 μg/mL], PMSF [18 μg/mL], and 1% Triton-X-100). The scraped suspensions were centrifuged (14,000g, 10 minutes) at 4°C, and protein content was determined using DC protein assay (Bio-Rad Laboratories). Cellular lysates were mixed with Laemmli sample buffer, and proteins were separated by SDS-PAGE for Western blot analysis with anti-p75, anti-p40, anti-phospho-Ser 473 (P)-Akt, anti-Akt, anti-phospho-Tyr180/182 (P)-p38 MAPK, antiinhibitor of nuclear factor κB (IκB) α (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), and anti-phospho-Thr183/Tyr185 (P)-extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 MAPK (Promega, Madison, MI). All animal experiments were performed according to protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at Vanderbilt University. Six- to 8-week-old C57BL/6 mice were killed; the colon was opened and washed with sterile PBS and DMEM media, and then cut into 4 × 4 mm pieces. The colon explants were laid on Netwell inserts (membrane mesh size of 500 μmol/L; Corning Incorporated Life Sciences, Acton, MA) with the serosal layer facing the insert. DMEM containing 0.5% FBS was filled to a point just over the epithelium and incubated at 37°C with 5% CO2 for 2 hours before treatment. At the end of the experiment, colon tissue was fixed in 4% paraformaldehyde at 4°C overnight before sectioning. Paraffin-embedded tissue sections were stained with H&E for light microscopic assessment of epithelial injury or for apoptosis assays. Apoptosis was detected in colon tissue slides by ApopTag In Situ Oligo Ligation (ISOL) Kit (Intergen Company, Purchase, NY) using T4 DNA ligase according to the manufacturer’s guidelines or by using antiactive caspase-3 antibody (BD Biosciences, Palo Alto, CA) staining and reagents provided in the Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Differential interference contrast (DIC) microscopy was used as we have previously reported.24Yan F. John S.K. Wilson G. Jones D.S. Washington M.K. Polk D.B. Kinase suppressor of Ras protects intestinal epithelium from cytokine-mediated apoptosis during inflammation.J Clin Invest. 2004; 114: 1272-1280Google Scholar Apoptotic cells were determined by counting the absolute number of positive stained cells in at least 300 colonic crypts. Apoptosis in cell lines was detected by 2 methods. ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kits (TUNEL; Intergen Company) and DAPI staining were described previously.24Yan F. John S.K. Wilson G. Jones D.S. Washington M.K. Polk D.B. Kinase suppressor of Ras protects intestinal epithelium from cytokine-mediated apoptosis during inflammation.J Clin Invest. 2004; 114: 1272-1280Google Scholar, 25Yan F. John S.K. Polk D.B. Kinase suppressor of Ras determines survival of intestinal cells exposed to tumor necrosis factor.Cancer Res. 2001; 61: 8668-8675Google Scholar The slides were observed by fluorescence microscopy, and the number of positive stained cells within a population of at least 500 cells was counted to determine the proportion of apoptotic cells. For Annexin V-FITC staining, attached cells were dissociated using Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, CA) and double stained with Annexin V-FITC and propidium iodide (Calbiochem/EMD Biosciences, Darmstadt, Germany) according to the respective manufacturer’s instructions. The percentage of cells positive for Annexin V and propidium iodide was determined by flow cytometry. After YAMC cells cultured in 96-well dishes were treated with LGG, purified p75, or purified p40 for 24 hours, cells were incubated with CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (Promega Corporation) for 1 hour to label viable cells. The absorbance at 590 mm was detected using a 96-well plate reader. Cell numbers were determined by comparing the absorbance of samples to the standard cell-absorbance curve generated for each experiment. The change in the number of control cells from the start to the end of an experiment was standardized as 100%. The changes in the treated cells were reported as a percentage relative to the untreated control. Cell proliferation was also determined by immunostaining of cells on chamber slides with antiproliferative cell nuclear antigen (PCNA) antibody (Santa Cruz Biotechnology) using reagents provided in the Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Inc.) and visualization of cells by DIC microscopy. At least 500 cells were counted to determine the percentage of cells with positive PCNA nuclei. The statistical significance of the difference between mean values was determined using paired Student t test analysis. The level of statistical significance was set at P < .05. Data were analyzed as the mean ± SD. Soluble factors recovered from LGG-s and LGG-CM have been shown to regulate intestinal epithelial signaling pathways and biologic functions,19Yan F. Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells.J Biol Chem. 2002; 277: 50959-50965Google Scholar, 22Tao Y. Drabik K.A. Waypa T.S. Musch M.W. Alverdy J.C. Schneewind O. Chang E.B. Petrof E.O. Soluble factors from Lactobacillus GG activate MAPKs and induce cytoprotective heat shock proteins in intestinal epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol. 2006; 290: C1018-C1030Google Scholar but the identities of these factors are unknown. Therefore, we pursued characterization of these soluble factors to provide insight into the molecular mechanisms of probiotic bacterial actions on host cells. As a first step, proteins in the culture supernatant of LGG broth cultures were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie blue staining. Two of the most abundant proteins had molecular masses of approximately 75 kilodaltons and 40 kilodaltons. To purify these proteins from LGG-s, filtered LGG-s was loaded onto UNOsphere S ion exchange media with negatively charged functional groups, and bound proteins were eluted using 30 mmol/L Tris (pH 7.3) containing progressively increasing concentrations of NaCl from 0.1 mol/L to 0.8 mol/L. Eluted proteins were analyzed by SDS-PAGE to identify proteins contained in each fraction (data not shown). The 75-kilodalton protein (p75) and 40-kilodalton protein (p40) eluted from the cation exchange resin at NaCl concentrations of 0.25 mol/L and 0.5 mol/L, respectively (Figure 1A). SDS-PAGE analysis indicated that the chromatography procedure successfully separated p75 and p40. Anti-p75 and anti-p40 polyclonal antibodies were generated using chromatographically purified p75 or p40, respectively. Western blot analysis indicated that the anti-p75 antiserum recognized p75 only (Figure 1B), and the anti-p40 antiserum reacted with both p40 and p75 (Figure 1C). Preimmune sera did not react with either p75 or p40 (Figures 1B and 1C). Immunoblotting experiments indicated that the purified p75 preparation was not contaminated with p40, and the purified p40 preparation was not contaminated with p75 (Figures 1B and 1C). As a first step in characterizing p75 and p40, N-terminal sequences and internal peptide sequences of these proteins were determined, as described in the Materials and Methods section. When compared with sequences in the NCBI microbial genome database, the p75 and p40 peptide sequences were most closely related to 2 proteins predicted to be encoded by the genome of L casei 334 (NCBI GeneBank accession numbers COG0791 and COG3883 , respectively). Multiple oligonucleotide primers were designed based on the sequences of the corresponding L casei genes and flanking DNA sequences in the L casei genome, and these primers were used to PCR-amplify related sequences from LGG genomic DNA. Sequence analysis of 1 set of cloned PCR products revealed the presence of a 1236-base pair (bp) open reading frame (ORF), predicted to encode a 412 amino acid residue protein with a calculated molecular mass of 42 kilodaltons (Figure 1D). The experimentally determined N-terminal amino acid sequence of LGG p40, as well as an internal peptide sequence of p40, was identified within the deduced amino acid sequence encoded by this ORF (Figure 1D). The deduced full-length amino acid sequence of p40 was 79% identical to the sequence of a 396 amino acid protein of unknown function in L casei 334 (NCBI GeneBank COG3883). Sequence analysis of another set of cloned PCR products revealed the presence of a partial ORF that was >1488 bp in length; the full-length ORF was not successfully amplified. The experimentally determined N-terminal amino acid sequence of p75 and internal peptide sequences of p75 were identified within the deduced amino acid sequence encoded by this partial ORF (Figure 1D). The deduced amino acid sequence of p75 was most closely related to a 493 amino acid cell wall-associated hydrolase of L casei 334 (NCBI GeneBank COG0791) and exhibited 70% and 93% identity to 2 different regions of this L casei 334 protein, respectively. The predicted molecular mass of the full-length cell wall-associated hydrolase of L casei 334 (49 kilodaltons) differs substantially from the molecular mass of the LGG p75 protein. An analysis of the LGG p40 and p75 gene sequences and the experimentally determined N-terminal amino acid sequences of the encoded proteins indicates that bo

Chronic use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs results in a significant reduction of risk and mortality from colorectal cancer in humans. All of the mechanism(s) by which nonsteroidal anti-inflammatory drugs exert their protective effects are not completely understood, but they are known to inhibit cyclooxygenase activity. The cyclooxygenase enzymes catalyze a key reaction in the conversion of arachidonic acid to prostaglandins, such as prostaglandin E2 (PGE2). Here we demonstrate that PGE2 treatment of LS-174 human colorectal carcinoma cells leads to increased motility and changes in cell shape. The prostaglandin EP4 receptor signaling pathway appears to play a role in transducing signals which regulate these effects. PGE2 treatment results in an activation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway that is required for the PGE2-induced changes in carcinoma cell motility and colony morphology. Our results suggest that PGE2 might enhance the invasive potential of colorectal carcinoma cells via activation of major intracellular signal transduction pathways not previously reported to be regulated by prostaglandins. Chronic use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs results in a significant reduction of risk and mortality from colorectal cancer in humans. All of the mechanism(s) by which nonsteroidal anti-inflammatory drugs exert their protective effects are not completely understood, but they are known to inhibit cyclooxygenase activity. The cyclooxygenase enzymes catalyze a key reaction in the conversion of arachidonic acid to prostaglandins, such as prostaglandin E2 (PGE2). Here we demonstrate that PGE2 treatment of LS-174 human colorectal carcinoma cells leads to increased motility and changes in cell shape. The prostaglandin EP4 receptor signaling pathway appears to play a role in transducing signals which regulate these effects. PGE2 treatment results in an activation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway that is required for the PGE2-induced changes in carcinoma cell motility and colony morphology. Our results suggest that PGE2 might enhance the invasive potential of colorectal carcinoma cells via activation of major intracellular signal transduction pathways not previously reported to be regulated by prostaglandins. nonsteroidal anti-inflammatory drug E-prostanoid prostaglandin extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein phosphatidylinositol 3-kinase reverse transcription polymerase chain reaction cyclooxygenase phosphate-buffered saline focal adhesion kinase protein kinase B There is a 40–50% reduction in the relative risk of colorectal cancer and colorectal cancer-associated mortality in individuals taking nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)1 (1Thun M.J. Namboodiri M.M. Calle E.E. Flanders W.D. Heath C.W.J. Cancer Res. 1993; 53: 1322-1327PubMed Google Scholar, 2Peleg I.I. Maibach H.T. Brown S.H. Wilcox C.M. Arch. Int. Med. 1994; 154: 394-399Crossref PubMed Scopus (220) Google Scholar, 3Giovannucci E. Egan K.M. Hunter D.J. Stampfer M.J. Colditz G.A. Willett W.C. Speizer F.E. N. Engl. J. Med. 1995; 333: 609-614Crossref PubMed Scopus (975) Google Scholar). Inhibition of cyclooxygenase-2 (COX-2) activity is thought to represent one of the mechanisms by which NSAIDs exert their anti-neoplastic effects (Refs. 4Sheng H. Shao J. Kirkland S.C. Isakson P. Coffey R.J. Morrow J.D. Beauchamp R.D. DuBois R.N. J. Clin. Invest. 1997; 99: 2254-2259Crossref PubMed Scopus (695) Google Scholarand 5Sheng H. Shao J. Morrow J.D. Beauchamp R.D. DuBois R.N. Cancer Res. 1998; 58: 362-366PubMed Google Scholar; reviewed in Ref. 6Williams C.S. Mann M. DuBois R.N. Oncogene. 1999; 18: 7908-7916Crossref PubMed Scopus (1236) Google Scholar). In support of this hypothesis, lack of the COX-2 (prostaglandin endoperoxide synthase-2) gene results in a reduction of the number of tumors which develop in mice heterozygous for an APCΔ716 mutation by more than 7-fold (7Oshima M. Dinchuk J.E. Kargman S. Oshima H. Hancock B. Kwong E. Trzaskos J.M. Evans J.F. Taketo M.M. Cell. 1996; 87: 803-809Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2268) Google Scholar). Additionally, COX-2 expression in colorectal carcinoma cells provides a growth and survival advantage (5Sheng H. Shao J. Morrow J.D. Beauchamp R.D. DuBois R.N. Cancer Res. 1998; 58: 362-366PubMed Google Scholar, 8Tsujii M. DuBois R.N. Cell. 1995; 83: 493-501Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2129) Google Scholar), and increases tumor cell invasiveness (9Tsujii M. Sunao K. DuBois R.N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 3336-3340Crossref PubMed Scopus (1324) Google Scholar). Treatment with selective COX-2 inhibitors significantly reduces the adenoma burden in humans (10Steinbach G. Lynch P.M. Phillips R.K. Wallace M.H. Hawk E. Gordon G.B. Wakabayashi N. Saunders B. Shen Y. Fujimura T. Su L. Levin B. Godio L. Patterson S. Rodriguez-Bigas M.A. Jester S.L. King K.L. Schumacher M. Abbruzzese J. DuBois R.N. Hittelman W.H. Zimmerman S. Sherman J.W. Kelloff G. N. Engl. J. Med. 2000; 342: 1946-1952Crossref PubMed Scopus (2247) Google Scholar) and in animals (11Reddy B.S. Hirose Y. Lubet R. Steele V. Kelloff G. Paulson S. Seibert K. Rao C.V. Cancer Res. 2000; 60: 293-297PubMed Google Scholar). There are two isoforms of prostaglandin endoperoxide synthase, which are commonly referred to as COX-1 and COX-2. COX-1 is produced constitutively in many different cell types and tissues (12O'Neill G. Hutchinson A.F. FEBS Lett. 1993; 330: 156-160Crossref PubMed Scopus (732) Google Scholar), but its expression can be regulated under some circumstances (13Smith C.J. Morrow J.D. Roberts L.J., II Marnett L.J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 192: 787-793Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). COX-2 is induced by cytokines, growth factors, and tumor promoters (reviewed in Ref. 14Williams C.S. DuBois R.N. Am. J. Physiol. 1996; 270: G393-G400PubMed Google Scholar). In studies of human colorectal cancer, COX-2 levels are increased in about 90% of cancers and ∼50% of pre-malignant colorectal adenomas, but the enzyme is not usually detected in adult intestinal tissues (15Eberhart C.E. Coffey R.J. Radhika A. Giardiello F.M. Ferrenbach S. DuBois R.N. Gastroenterology. 1994; 107: 1183-1188Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Kargman S.L. O'Neill G.P. Vickers P.J. Evans J.F. Mancini J.A. Jothy S. Cancer Res. 1995; 55: 2556-2559PubMed Google Scholar). Cyclooxygenase catalyzes the conversion of arachidonic acid to prostaglandin (PG) G2 and PGH2. PGH2 is subsequently converted to a variety of prostaglandins, which include PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2, and thromboxane A2 by each respective prostaglandin synthase. Prostaglandins are synthesized by a wide variety of human tissues and serve as autocrine or paracrine lipid mediators to signal changes within their immediate environment. PGs are involved in diverse biological processes, which include inflammation, blood clotting, ovulation, implantation, initiation of labor, bone metabolism, nerve growth, wound healing, kidney function, blood vessel tone, and immune responses (reviewed in Ref. 17DuBois R.N. Abramson S.B. Crofford L. Gupta R.A. Simon L.S. Van De Putte L.B.A. Lipsky P.E. FASEB J. 1998; 12: 1063-1073Crossref PubMed Scopus (2198) Google Scholar). The precise contribution of increased biosynthesis of prostaglandins by COX-2 to the progression of neoplasia is currently under evaluation. For example, PGE2 generated in colorectal carcinomas may enhance cell survival and/or may affect other aspects of epithelial cell behavior such as cell-cell or cell-substrate adhesion (5Sheng H. Shao J. Morrow J.D. Beauchamp R.D. DuBois R.N. Cancer Res. 1998; 58: 362-366PubMed Google Scholar). A link between the neoplastic effect of carcinogen treatment and prostaglandin signaling was recently made by the observation that genetic disruption of the E-prostanoid receptor subtype 1 (EP1) results in a reduction in the number of aberrant crypt foci that develop in mice following carcinogen treatment (18Watanabe K. Kawamori T. Nakatsugi S. Ohta T. Ohuchida S. Yamamoto H. Maruyama T. Kondo K. Ushikubi F. Narumiya S. Sugimura T. Wakabayashi K. Cancer Res. 1999; 59: 5093-5096PubMed Google Scholar). Based on these findings, we sought to determine the effects of PGE2 on the biology of colorectal carcinoma cells. We found that PGE2 stimulated an increase in the proliferation and motility of colorectal carcinoma cells. LS-174 cells were purchased from ATCC (Manassas, VA). The cells were maintained in McCoy's 5A medium containing 10% fetal bovine serum. LY 294002 and wortmannin were purchased from Calbiochem (La Jolla, CA). PGE2, butaprost, sulprostone, and PGE1 alcohol were purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Immunoblot analysis was performed as described previously (19Sheng G.G. Shao J. Sheng H. Hooton E.B. Isakson P.C. Morrow J.D. Coffey R.J. DuBois R.N. Beauchamp R.D. Gastroenterology. 1997; 113: 1883-1891Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar). Cells were lysed for 30 min in radioimmunoprecipitation assay buffer (1× PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg/ml aprotinin, 1 mm sodium orthovanadate) and then clarified cell lysates were denatured and fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, the proteins were transferred to nitrocellulose membranes and the filters were incubated with the antibodies indicated and developed by the enhanced chemiluminescence system (ECL, Amersham Pharmacia Biotech). The anti-phosphorylated Akt antibody was purchased from New England Biolabs (Beverly, MA), and the anti-active ERK1/2 antibody was fromPromega (Madison, WI). 1 × 104 cells were suspended in 0.5 ml of 1:2 diluted Matrigel® (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), and the mixture was plated into 24-well plates. PGE2in fresh medium was added to the cell culture every 2 days. After the plates were incubated for 10–15 days, they were photographed using a camera attached to an inverted microscope. Relative colony size was determined by measuring 10 random colonies in each slide (50 measurements/well). The mean for each treatment set was calculated and compared with controls. p42/p44 MAP kinase activity was measured by determining the transfer of the phosphate group of adenosine 5′-triphosphate to a peptide that is a highly specific substrate for p42/44 MAP kinase (Biotrak system, Amersham Pharmacia Biotech). For determination of Akt kinase activity we used the Akt kinase assay kit made by New England Biolabs (Beverly, MA) according to the manufacturer's instructions. Serum-starved cells were treated with PGE2 and then lysed at the indicated times. Akt was immunoprecipitated using a monospecific Akt antibody. The immunoprecipitate was then incubated with a GSK-3 fusion protein in the presence of ATP. Phosphorylation of GSK-3 was measured by Western blotting using an anti-phospho-GSK-3α/β (Ser21/9) antibody. PI3K assays were performed as described by Jianget al. (20Jiang K. Coppola D. Crespo N.C. Nicosia S.V. Hamilton A.D. Sebti S.M. Cheng J.Q. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 139-148Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar). Cells were lysed and immunoprecipitated with anti-Tyr(P) antibody (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). The activity of PI3K in immunoprecipitates was determined by incubating the beads with reaction buffer (10 mm Hepes, pH 7.4, 10 mm MgCl2, 50 μm ATP, 20 μCi of [γ-32P]ATP, and 10 μg ofl-α-phosphatidylinositol-4-phosphate) for 20 min at 25 °C. Phosphorylated products were separated by thin layer chromatography and visualized by autoradiography. LS-174 cells were grown in 35-mm tissue culture plates and fixed in methanol/acetone at −20 °C for 10 min. Fixed cells were incubated with 10% normal donkey serum for 1 h and then with anti-FAK or anti-paxillin antibody (Transduction Laboratories, Lexington, KY) for 2 h at room temperature. After washing the cells three times with PBS, they were incubated with Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) for an additional 1 h. The cells were then washed with PBS, mounted, and observed under fluorescent microscopy with appropriate filters. For direct immunofluorescence, cells were fixed with formaldehyde-Triton solution and then incubated with 10 nm fluorescent phalloidin for 30 min. Cell migration and invasion assays were carried out using Transwell chambers (8 μm, Corning Costar Co., Cambridge, MA). 5 × 104 cells suspended in 400 μl of serum-free McCoy's 5A medium were placed in the uncoated (migration assay) or 1:10 diluted Matrigel®-coated (invasion assay) upper chamber. The lower chamber was filled with 1 ml of McCoy's 5A medium containing vehicle or 0.1 μm PGE2. After an incubation period of 20 h at 37 °C, the cells on the upper surface of the filter were removed with a cotton swab. The filters were fixed and stained with 0.5% crystal violet solution. Cells adhering to the undersurface of the filter were counted. Three independent experiments were carried out, and the data are expressed as the mean ± S.E. of assays performed in triplicate. RT-PCR was carried out using the RNA PCR kit from PerkinElmer Life Sciences. A set of specific PCR primers for EP receptor subtypes (GenBank™ accession numbers NM000955, NM0000956, NM000957, and NM000958 for EP1, EP2, EP3, and EP4, respectively) have been designed as follows: EP1 fragment, forward (5′-ACCGACCTGGCGGGCCACGTGA-3′; 321–342) and reverse (5′-CGCTGAGCGTGTTGCACACCAG-3′; 750–729); EP2 fragment, forward (5′-TCCAATGACTCCCAGTCTGAGG-3′; 169–190) and reverse (5′-TGCATAGATGACAGGCAGCACG-3′; 642–621); EP3 fragment, forward (5′-GATCACCATGCTGCTCACTG-3′; 396–415) and reverse (5′-AGTTATGCGAAGAGCTAGTCC-3′; 904–884); EP4 fragment, forward (5′-GGGCTGGCTGTCACCGACCTG-3′; 565–585) and reverse (5′-GGTGCGGCGCATGAACTGGCG-3′; 1050–1030). One μg of total RNA was reverse-transcribed and amplified with 35 PCR cycles. The amplified products were visualized on 1.5% agarose gels. Constitutive expression of COX-2 has been reported in 85–90% of colorectal carcinomas (15Eberhart C.E. Coffey R.J. Radhika A. Giardiello F.M. Ferrenbach S. DuBois R.N. Gastroenterology. 1994; 107: 1183-1188Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Kargman S.L. O'Neill G.P. Vickers P.J. Evans J.F. Mancini J.A. Jothy S. Cancer Res. 1995; 55: 2556-2559PubMed Google Scholar). COX-2 is expressed in both carcinoma and stromal cells (21Chapple K.S. Cartwright E.J. Hawcroft G. Tisbury A. Bonifer C. Scott N. Windsor A.C.J. Guillou P.J. Markham A.F. Coletta P.L. Hull M.A. Am. J. Pathol. 2000; 156: 545-553Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar). Therefore, it is possible that carcinoma cells that do not express COX-2 could receive paracrine signals from PGE2 produced by neighboring stromal cells. In order to elucidate whether PGE2 might exert any effect on the phenotype of colon cancer cells, LS-174 human colon cancer cells were treated with PGE2. LS-174 cells do not generate detectable prostaglandins, although COX-2 protein is detected in this cell line (22Shao J. Sheng H. Inoue H. Morrow J.D. DuBois R.N. J. Biol. Chem. 2000; 275: 33951-33956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar). LS-174 cells are able to form “crypt-like” aggregates when they are cultured in Matrigel®. We found that exogenously added PGE2 exerted a growth-stimulatory effect on LS-174 cells (Fig.1 A). The size of LS-174 colonies in Matrigel® increased following PGE2treatment in a dose-dependent manner (Fig. 1 B). Treatment with 10 nm PGE2 resulted in optimal stimulation of LS-174 cell growth, causing a 2-fold increase in colony diameter. To our surprise, treatment with PGE2 caused a dramatic change in the morphology of the LS-174 colonies. When grown in extracellular matrix components (Matrigel®), LS-174 cells formed well organized structures consisting of an outside layer of cells with an acellular center (Fig.2 A, panel a). Positive Alcian Blue staining indicated that the LS-174 colonies were filled with colonic type mucin (data not shown). In contrast, the LS-174 cells exposed to PGE2 formed irregular solid clumps of cells with a poorly organized structure (Fig.2 A, panel b). When grown on plastic culture dishes, LS-174 cells formed in “non-spreading” round clumps (Fig. 2 A, panel c). Addition of 10 nm PGE2 led to a rapid change in phenotype, which included increased spreading of cells within 2–4 h (Fig.2 A, panel d). Fluorescent staining with rhodamine-phalloidin demonstrated that PGE2 treatment for 24 h resulted in protruding actin filaments from the cell periphery in the form of microspikes (Fig. 2 B,panel b, white arrows) and an increase in the number of stress fibers (Fig. 2 B,panel b, black arrows). PGE2 treatment also increased focal adhesion complexes as determined by immunostaining for focal adhesion kinase (FAK) and paxillin. Normally, FAK and paxillin are localized to the cytoplasm in LS-174 cells (Fig. 2 B, panels c ande), but following PGE2 treatment the proteins accumulated into focal adhesions at the ends of actin stress fibers (Fig. 2 B, panels d and f,arrows). To further examine the spreading behavior induced by PGE2, we carried out experiments using a modified Boyden chamber. Treatment of cells with PGE2 resulted in a significant increase (2–3-fold) in cell motility (Fig.3 A). Addition of 0.1 μm PGE2 also promoted the movement of LS-174 cells through a Matrigel®-coated polycarbonate membrane by 2–3-fold (Fig. 3 B). Therefore, PGE2 altered the behavior of LS-174 cells by stimulating an increase in their motility, which could explain, in part, their change in cellular organization when grown as multicellular colonies. We next determined if LS-174 cells express EP receptors, which are known to bind PGE2 with a high affinity (reviewed in Ref. 23Breyer M.D. Breyer R.M. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2000; 9: 23-29Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). The expression of EP receptors in LS-174 cells was determined by RT-PCR using specific oligonucleotide primers. EP2, EP3, and EP4 were clearly expressed in LS-174 cells (Fig. 4 A), but mRNA for the EP1 receptor was barely detectable. To elucidate the functional role of EP receptor subtypes in LS-174 cells, we treated the cells with butaprost (1 μm, a selective EP2 receptor agonist), sulprostone (5 μm, a selective EP3 receptor agonist), and PGE1alcohol (10 nm, a selective EP4 receptor agonist). Treatment with butaprost or sulprostone did not cause significant changes in cell morphology (data not shown). However, treatment with the PGE1 alcohol (10 nm) resulted in more rapid and significant cell spreading when compared with the effect of PGE2 alone. Alterations in LS-174 cell spreading were seen within 1 h following addition of the PGE1 alcohol (Fig. 4 B). Thus, LS-174 cell spreading and migration, stimulated by PGE2, may be predominantly mediated through the EP4 signaling pathway. A number of signaling pathways is known to regulate cell growth and motility. The MAP kinase/ERK kinase/extracellular signal-regulated kinase (ERK) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathways were evaluated following PGE2 treatment. Treatment of LS-174 cells with PGE2 (100 nm) only had a modest effect on the activity of ERK1/2. PGE2 treatment slightly increased the levels of phosphorylated ERK1/2 as determined by Western blotting analysis (Fig.5 A, upper panel). The results of an ERK kinase assay confirmed this finding (Fig. 5 A, lower panel). On the other hand, treatment with PGE2 led to a marked activation of the PI3K/Akt pathway. The levels of phosphorylated (Ser-473) Akt/PKB were elevated following treatment with PGE2 in LS-174 cells (Fig. 5 B, upper panel). Kinase assays, which measure the capacity to phosphorylate GSK-3 kinase, demonstrated that Akt kinase activity was greatly increased following PGE2 treatment of LS-174 cells (Fig. 5 B, lower panel). It is known that Akt/PKB can be activated by G protein-coupled signaling in both a PI3K-dependent and -independent manner. Kinase assays failed to detect any PI3K activity in serum-starved LS-174 cells, and treatment with PGE2 resulted in rapid induction of PI3K activity, as determined by the conversion of phosphatidylinositol 4-phosphate to phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (Fig. 5 C). To confirm the involvement of PI3K in PGE2 activation of Akt/PKB, we evaluated two inhibitors of this pathway (wortmannin (0.1 μm) and LY 294002 (10 μm)) and found that they both completely blocked PGE2-induced phosphorylation of Akt/PKB (Fig.5 D). To determine whether the activation of Akt/PKB by PGE2 altered the phenotype of LS-174 cells, the cells were treated with PGE2 in the presence of specific PI3K inhibitors, LY 294002 (5 μm) and wortmannin (0.1 μm). Both LY-294002 and wortmannin, at low concentrations, have been demonstrated to specifically target PI3K activity (24Vlahos C.J. Matter W.F. Hui K.Y. Brown R.F. J. Biol. Chem. 1994; 269: 5241-5248Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). LS-174 cells were grown on plastic dishes and subjected to serum deprivation for 48 h. The cells were then treated with PGE2 (0.1 μm) in the presence or absence of LY 294002 or wortmannin for 24 h. DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine incorporation assays. PGE2treatment resulted in a 70% increase in [3H]thymidine incorporation in LS-174 cells, and addition of 5 μm LY 294002 completely blocked the PGE2-induced increase in DNA synthesis. The presence of 0.1 μm wortmannin also abolished the PGE2 effect on DNA synthesis (Fig.6 A). Although inhibition of PI3K/Akt activity blocked PGE2-induced growth effects, LY 294002 and wortmannin (0.1 μm) also prevented the PGE2-induced cell spreading in LS-174 cells (Fig.6 B and data not shown). Next, we evaluated the role of PI3K/Akt activity on cell motility. Modified Boyden chamber assays demonstrated that PGE2 treatment resulted in a 2–2.5-fold increase in cell motility, and 5 μm LY 294002 or 0.1 μm wortmannin completely abolished this effect (Fig. 6,C and D). Since PGE2 treatment dramatically altered the growth and morphology of LS-174 colonies in Matrigel®, it was of interest to determine the effects of PI3K/Akt activity on LS-174 cells grown in Matrigel®. As demonstrated in Fig.7 A, LY 294002 impaired the ability of LS-174 cells to grow in Matrigel® whereas PGE2 significantly increased the size and altered the morphology of LS-174 colonies. Interestingly, addition of LY 294002 completely blocked the PGE2 effects on cells grown in Matrigel® by inhibiting colony growth and the invasive morphology. Wortmannin exerted similar effects but to a lesser degree on LS-174 cells grown in Matrigel® (Fig. 7 B and data not shown). It is now clear that COX-2 plays a role in the promotion of colorectal cancer (6Williams C.S. Mann M. DuBois R.N. Oncogene. 1999; 18: 7908-7916Crossref PubMed Scopus (1236) Google Scholar). However, the effects of prostaglandins generated by COX-2 have largely been unexplored. Here we provide evidence that prostaglandin-mediated signaling affects cell proliferation, motility, and morphogenesis and that activation of the PI3K/Akt pathway is essential for the PGE2-induced changes in neoplastic potential. To evaluate the effect of prostaglandins on the behavior of colorectal carcinoma cells, we employed several approaches. Treatment with PGE2 stimulated DNA synthesis and cell spreading in LS-174 cells grown on plastic cultures. LS-174 cells form well differentiated multicellular colonies in Matrigel®, mimicking tumor growth in animals. Treatment of LS-174 colonies with PGE2led to a significant disruption of their cellular organization with increased motility. The stimulation of cell migration by PGE2 has been observed previously in mesangial, endothelial, and T cells (25Jaffer S. Mattana J. Singhal P.C. Am. J. Nephrol. 1995; 15: 300-305Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar, 26Leppert D. Hauser S.L. Kishiyama J.L. An S. Zeng L. Goetzl E.J. FASEB J. 1995; 9: 1473-1481Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 27Schmidt C. Laporte A. De Baetselier P. Invasion Metastasis. 1997; 17: 53-61PubMed Google Scholar). Forced expression of COX-2 in colon carcinoma cells results in increased invasiveness compared with the parental cells (9Tsujii M. Sunao K. DuBois R.N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 3336-3340Crossref PubMed Scopus (1324) Google Scholar). These findings suggest that a prostaglandin product, such as PGE2, might stimulate cell motility and invasiveness under certain circumstances. In the present study, we show that addition of PGE2 to serum-deprived LS-174 cells results in increased cell spreading accompanied by polymerization of actin and assembly of stress fibers, indicating that PGE2induced cytoskeletal reorganization. A role for the actin cytoskeleton has been implicated in many cellular functions, including motility, chemotaxis, cell division, endocytosis, and secretion (28Devreotes P.N. Zigmond S.H. Annu. Rev. Cell Biol. 1988; 4: 649-686Crossref PubMed Scopus (506) Google Scholar, 29Salmon E.D. Curr. Opin. Cell Biol. 1989; 1: 541-547Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 30Bretscher A. Annu. Rev. Cell Biol. 1991; 7: 337-374Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar). Our data also demonstrate that PGE2 treatment caused aggregation of FAK and paxillin, promoting the formation of focal adhesion complexes, which are known to be essential for cell migration (31Chen P. Xie H. Sekar M.C. Gupta K. Wells A. J. Cell Biol. 1994; 127: 847-857Crossref PubMed Scopus (284) Google Scholar, 32Kundra V. Escobedo J.A. Kazlauskas A. Kim H.K. Rhee S.G. Williams L.T. Zetter B.R. Nature. 1994; 367: 474-476Crossref PubMed Scopus (395) Google Scholar). PGE2 acts via specific transmembrane G protein-coupled receptors (EP receptors) (23Breyer M.D. Breyer R.M. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2000; 9: 23-29Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). Four EP receptor subtypes have been identified and are designated EP1, EP2, EP3, and EP4. EP1 signals via increased Ca2+, which leads to vasoconstriction. EP3 can also serve to stimulate vasoconstriction and inhibits the generation of cAMP, whereas EP2 and EP4 are known to mediate vasorelaxation by stimulating an increase in cAMP levels. Our results show that both sulprostone (EP3 agonist) and butaprost (EP2 agonist) (33Boie Y. Stocco R. Sawyer N. Slipetz D.M. Ungrin M.D. Neuschafer-Rube F. Puschel G.P. Metters K.M. Abramovitz M. Eur. J. Pharmacol. 1997; 340: 227-241Crossref PubMed Scopus (265) Google Scholar,34Kiriyama M. Ushikubi F. Kobayashi T. Hirata M. Sugimoto Y. Narumiya S. Br. J. Pharmacol. 1997; 122: 217-224Crossref PubMed Scopus (454) Google Scholar) did not mimic the effect of PGE2 to increase cell spreading. However, both the PGE1 alcohol and misoprostol (relatively selective EP4 agonist, data not shown) (33Boie Y. Stocco R. Sawyer N. Slipetz D.M. Ungrin M.D. Neuschafer-Rube F. Puschel G.P. Metters K.M. Abramovitz M. Eur. J. Pharmacol. 1997; 340: 227-241Crossref PubMed Scopus (265) Google Scholar, 34Kiriyama M. Ushikubi F. Kobayashi T. Hirata M. Sugimoto Y. Narumiya S. Br. J. Pharmacol. 1997; 122: 217-224Crossref PubMed Scopus (454) Google Scholar, 35De Vries G.W. Guarino P. McLaughlin A. Chen J. Andrews S. Woodward D.F. Br. J. Pharmacol. 1995; 115: 1231-1234Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar) induced significant cell spreading. These findings suggest that signaling via the EP4 receptor is, at least in part, responsible for the PGE2-induced changes in LS-174 cell behavior. Evidence suggests that the PI3K/Akt pathway promotes growth factor-mediated cell survival and inhibits apoptosis (36Yao R. Cooper G.M. Science. 1995; 267: 2003-2006Crossref PubMed Scopus (1284) Google Scholar). PI3K/Akt also plays a key role in the regulation of cell adhesion and actin rearrangement (37Rodriguez-Viciana P. Warne P.H. Khwaja A. Marte B.M. Pappin D. Das P. Waterfield M.D. Ridley A. Downward J. Cell. 1997; 89: 457-467Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar, 38Osada M. Tolkacheva T. Li W. Chan T.O. Tsichlis P.N. Saez R. Kimmelman A.C. Chan A.M. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 6333-6344Crossref PubMed Scopus (75) Google Scholar). These observations suggest that the PI3K/Akt pathway is oncogenic and involved in the neoplastic transformation of mammalian cells. PI3K can be activated by growth factors, oncogenes, and is involved in the transmission of signals from certain G protein-coupled receptors (39Franke T.F. Yang S.I. Chan T.O. Datta K. Kazlauskas A. Morrison D.K. Kaplan D.R. Tsichlis P.N. Cell. 1995; 81: 727-736Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1810) Google Scholar, 40Downward J. Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1997; 31: 1-10Crossref PubMed Google Scholar, 41Murga C. Fukuhara S. Gutkind J.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 12069-12073Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar). Akt is stimulated by a variety of agonists acting on G protein-coupled receptors (42Sable C.L. Filippa N. Hemmings B. Van Obberghen E. FEBS Lett. 1997; 409: 253-257Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar, 43Stephens L.R. Eguinoa A. Erdjument-Bromage H. Lui M. Cooke F. Coadwell J. Smrcka A.S. Thelen M. Cadwallader K. Tempst P. Hawkins P.T. Cell. 1997; 89: 105-114Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (490) Google Scholar, 44Murga C. Laguinge L. Wetzker R. Cuadrado A. Gutkind J.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19080-19085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (290) Google Scholar). Murga et al. (41Murga C. Fukuhara S. Gutkind J.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 12069-12073Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar) recently reported that PI3Kβ is necessary and sufficient to transmit signals from G proteins to Akt/PKB. Akt/PKB may also be activated by cyclic AMP-dependent protein kinase in a wortmannin-insensitive manner (42Sable C.L. Filippa N. Hemmings B. Van Obberghen E. FEBS Lett. 1997; 409: 253-257Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar, 45Filippa N. Sable C.L. Filloux C. Hemmings B. Van Obberghen E. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 4989-5000Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar). Here, we found that treatment with PGE2 rapidly increased the kinase activity of Akt/PKB and that wortmannin and LY 294002 blocked PGE2-induced phosphorylation of Akt/PKB, suggesting the involvement of PI3K. Thus far, the mechanism by which prostaglandin activates Akt/PKB is not clear, and, to our knowledge, this represents the first report of Akt/PKB modulation by PGE2. However, we have not established a direct link between the EP receptor and PI3K activation in the present study. Our data further demonstrate the involvement of Akt/PKB activity in the PGE2-induced increase in cell proliferation and motility. LY 294002, at low concentrations (5–20 μm), specifically targets PI3K activity (24Vlahos C.J. Matter W.F. Hui K.Y. Brown R.F. J. Biol. Chem. 1994; 269: 5241-5248Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The observation that both LY-294002 and wortmannin (structurally unrelated PI3K inhibitors) exerted similar effects on LS-174 cells indicates that PI3K is the likely target of these compounds (reviewed in Refs. 46Ward S.G. June C.H. Olive D. Immunol. Today. 1996; 17: 187-197Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar and 47Vanhaesebroeck B. Waterfield M.D. Exp. Cell Res. 1999; 253: 239-254Crossref PubMed Scopus (751) Google Scholar). We found that the growth of LS-174 cells (either on plasic or in Matrigel®) was significantly impaired by LY294002 (5 μm), suggesting that basal levels of PI3K/Akt activity are required for continuous growth of LS-174 cells. Specific inhibitors of PI3K that blocked the activation of Akt/PKB did inhibit PGE2-induced changes in cell behavior, suggesting that both PGE2-induced growth stimulation and cytoskeletal reorganization involve the activation of the PI3K/Akt pathway. Several studies demonstrated that Akt/PKB pathway plays an extremely important role in cell cycle progression via modifying the expression of cell cycle proteins, such as cyclin D1 and p27kip (48Gille H. Downward J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 22033-22040Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (369) Google Scholar, 49Muise-Helmericks R.C. Grimes H.L. Bellacosa A. Malstrom S.E. Tsichlis P.N. Rosen N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29864-29872Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (441) Google Scholar, 50Diehl J.A. Cheng M. Roussel M.F. Sherr C.J. Genes Dev. 1998; 12: 3499-3511Crossref PubMed Scopus (1837) Google Scholar, 51Medema R.H. Kops G.J. Bos J.L. Burgering B.M. Nature. 2000; 404: 782-787Crossref PubMed Scopus (1207) Google Scholar). Activation of the PI3K/Akt pathway is thought to be essential for cytoskeletal reorganization under certain circumstances (37Rodriguez-Viciana P. Warne P.H. Khwaja A. Marte B.M. Pappin D. Das P. Waterfield M.D. Ridley A. Downward J. Cell. 1997; 89: 457-467Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). These previous studies strongly support our findings that the PI3K/Akt activity is required for PGE2-induced increases in the growth and invasiveness of LS-174 cells. Although COX enzyme activity is proposed to play a pro-neoplastic role in colorectal carcinogenesis, the downstream signaling that mediates these effects is poorly understood. Our results demonstrate that PGE2 can induce significant phenotypic alterations in colorectal carcinoma cells. These changes include increased motility, changes in cell shape, and stimulation of cell growth. We found the PI3K/Akt signaling pathway to be involved in the regulation of morphogenic and proliferative changes. This work establishes a role for PGE2 in the stimulation of tumor cell motility and reveals an additional cellular target, the EP4 receptor, which appears to be involved in this process.

Background & aimsStaging inadequately predicts metastatic risk in patients with colon cancer. We used a gene expression profile derived from invasive, murine colon cancer cells that were highly metastatic in an immunocompetent mouse model to identify patients with colon cancer at risk of recurrence.MethodsThis phase 1, exploratory biomarker study used 55 patients with colorectal cancer from Vanderbilt Medical Center (VMC) as the training dataset and 177 patients from the Moffitt Cancer Center as the independent dataset. The metastasis-associated gene expression profile developed from the mouse model was refined with comparative functional genomics in the VMC gene expression profiles to identify a 34-gene classifier associated with high risk of metastasis and death from colon cancer. A metastasis score derived from the biologically based classifier was tested in the Moffitt dataset.ResultsA high score was significantly associated with increased risk of metastasis and death from colon cancer across all pathologic stages and specifically in stage II and stage III patients. The metastasis score was shown to independently predict risk of cancer recurrence and death in univariate and multivariate models. For example, among stage III patients, a high score translated to increased relative risk of cancer recurrence (hazard ratio, 4.7; 95% confidence interval, 1.566–14.05). Furthermore, the metastasis score identified patients with stage III disease whose 5-year recurrence-free survival was >88% and for whom adjuvant chemotherapy did not increase survival time.ConclusionA gene expression profile identified from an experimental model of colon cancer metastasis predicted cancer recurrence and death, independently of conventional measures, in patients with colon cancer. Staging inadequately predicts metastatic risk in patients with colon cancer. We used a gene expression profile derived from invasive, murine colon cancer cells that were highly metastatic in an immunocompetent mouse model to identify patients with colon cancer at risk of recurrence. This phase 1, exploratory biomarker study used 55 patients with colorectal cancer from Vanderbilt Medical Center (VMC) as the training dataset and 177 patients from the Moffitt Cancer Center as the independent dataset. The metastasis-associated gene expression profile developed from the mouse model was refined with comparative functional genomics in the VMC gene expression profiles to identify a 34-gene classifier associated with high risk of metastasis and death from colon cancer. A metastasis score derived from the biologically based classifier was tested in the Moffitt dataset. A high score was significantly associated with increased risk of metastasis and death from colon cancer across all pathologic stages and specifically in stage II and stage III patients. The metastasis score was shown to independently predict risk of cancer recurrence and death in univariate and multivariate models. For example, among stage III patients, a high score translated to increased relative risk of cancer recurrence (hazard ratio, 4.7; 95% confidence interval, 1.566–14.05). Furthermore, the metastasis score identified patients with stage III disease whose 5-year recurrence-free survival was >88% and for whom adjuvant chemotherapy did not increase survival time. A gene expression profile identified from an experimental model of colon cancer metastasis predicted cancer recurrence and death, independently of conventional measures, in patients with colon cancer.

Initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is definitively linked to activating mutations in the KRAS oncogene. However, PDA mouse models show that mutant Kras expression early in development gives rise to a normal pancreas, with tumors forming only after a long latency or pancreatitis induction. Here, we show that oncogenic KRAS upregulates endogenous EGFR expression and activation, the latter being dependent on the EGFR ligand sheddase, ADAM17. Genetic ablation or pharmacological inhibition of EGFR or ADAM17 effectively eliminates KRAS-driven tumorigenesis in vivo. Without EGFR activity, active RAS levels are not sufficient to induce robust MEK/ERK activity, a requirement for epithelial transformation.

The NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for Gastric Cancer provide evidence- and consensus-based recommendations for a multidisciplinary approach for the management of patients with gastric cancer. For patients with resectable locoregional cancer, the guidelines recommend gastrectomy with a D1+ or a modified D2 lymph node dissection (performed by experienced surgeons in high-volume centers). Postoperative chemoradiation is the preferred option after complete gastric resection for patients with T3-T4 tumors and node-positive T1-T2 tumors. Postoperative chemotherapy is included as an option after a modified D2 lymph node dissection for this group of patients. Trastuzumab with chemotherapy is recommended as first-line therapy for patients with HER2-positive advanced or metastatic cancer, confirmed by immunohistochemistry and, if needed, by fluorescence in situ hybridization for IHC 2+.

The College of American Pathologists offers these protocols to assist pathologists in providing clinically useful and relevant information when reporting results of surgical specimen examinations. The College regards the reporting elements in the “Surgical Pathology Cancer Case Summary (Checklist)” portion of the protocols as essential elements of the pathology report. However, the manner in which these elements are reported is at the discretion of each specific pathologist, taking into account clinician preferences, institutional policies, and individual practice.The College developed these protocols as an educational tool to assist pathologists in the useful reporting of relevant information. It did not issue the protocols for use in litigation, reimbursement, or other contexts. Nevertheless, the College recognizes that the protocols might be used by hospitals, attorneys, payers, and others. Indeed, effective January 1, 2004, the Commission on Cancer of the American College of Surgeons mandated the use of the checklist elements of the protocols as part of its Cancer Program Standards for Approved Cancer Programs. Therefore, it becomes even more important for pathologists to familiarize themselves with these documents. At the same time, the College cautions that use of the protocols other than for their intended educational purpose may involve additional considerations that are beyond the scope of this document.This protocol applies to all primary carcinomas of the colon and rectum. Well-differentiated neuroendocrine neoplasms (carcinoid tumors) are not included. The seventh edition TNM staging system for carcinoma of the colon and rectum of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) and the International Union Against Cancer (UICC) is recommended.Select a Single Response Unless Otherwise Indicated* Data elements with asterisks are not required. However, these elements may be clinically important but are not yet validated or regularly used in patient management.Tumor Site (note A)__ Cecum__ Right (ascending) colon__ Hepatic flexure__ Transverse colon__ Splenic flexure__ Left (descending) colon__ Sigmoid colon__ Rectum__ Other (specify): ______ Not specified*Specimen Integrity*__ Intact*__ Fragmented*Polyp Size* Greatest dimension: __ cm* Additional dimensions: __ × __ cm*__ Cannot be determined (see Comment)*Polyp Configuration*__ Pedunculated with stalk * Stalk length: __ cm*__ SessileSize of Invasive CarcinomaGreatest dimension: __ cm* Additional dimensions: __ × __ cm__ Cannot be determined (see Comment)Histologic Type (note B)__ Adenocarcinoma__ Mucinous adenocarcinoma__ Signet-ring cell carcinoma__ Small cell carcinoma__ Squamous cell carcinoma__ Adenosquamous carcinoma__ Medullary carcinoma__ Undifferentiated carcinoma__ Other (specify): ______ Carcinoma, type cannot be determinedHistologic Grade (note C)__ Not applicable__ Cannot be determined__ Low grade (well differentiated to moderately differentiated)__ High grade (poorly differentiated to undifferentiated)Microscopic Tumor Extension (note D)__ Cannot be determinedInvasion (deepest): __ Lamina propria __ Muscularis mucosae __ Submucosa __ Muscularis propriaMargins (select all that apply)Deep Margin (Stalk Margin)__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma Distance of invasive carcinoma from margin: __ mm__ Involved by invasive carcinomaMucosal/Lateral Margin__ Not applicable__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma__ Involved by invasive carcinoma__ Involved by adenomaLymph-Vascular Invasion (notes D and E)__ Not identified__ Present__ Indeterminate*Type of Polyp in Which Invasive Carcinoma Arose (note F)*__ Tubular adenoma*__ Villous adenoma*__ Tubulovillous adenoma*__ Traditional serrated adenoma*__ Sessile serrated adenoma*__ Hamartomatous polyp*__ Indeterminate*Additional Pathologic Findings (select all that apply)*__ None identified*__ Inflammatory bowel disease *__ Active *__ Quiescent*__ Other (specify): ____*Ancillary Studies* Specify: ____*__ Not performed*Comment(s): ____Select a Single Response Unless Otherwise Indicated* Data elements with asterisks are not required. However, these elements may be clinically important but are not yet validated or regularly used in patient management.Specimen (select all that apply) (note A)__ Terminal ileum__ Cecum__ Appendix__ Ascending colon__ Transverse colon__ Descending colon__ Sigmoid colon__ Rectum__ Anus__ Other (specify): ______ Not specifiedProcedure__ Right hemicolectomy__ Transverse colectomy__ Left hemicolectomy__ Sigmoidectomy__ Rectal/rectosigmoid colon (low anterior resection)__ Total abdominal colectomy__ Abdominoperineal resection__ Transanal disk excision (local excision)__ Other (specify): ______ Not specified*Specimen Length (if applicable)* Specify: __ cmTumor Site (select all that apply) (note A)__ Cecum__ Right (ascending) colon__ Hepatic flexure__ Transverse colon__ Splenic flexure__ Left (descending) colon__ Sigmoid colon__ Rectosigmoid__ Rectum__ Colon, not otherwise specified__ Cannot be determined (see Comment)Tumor SizeGreatest dimension: __ cm* Additional dimensions: __ × __ cm__ Cannot be determined (see Comment)Macroscopic Tumor Perforation (note G)__ Present__ Not identified__ Cannot be determined*Macroscopic Intactness of Mesorectum (note H)*__ Not applicable*__ Complete*__ Near complete*__ Incomplete*__ Cannot be determinedHistologic Type (note B)__ Adenocarcinoma__ Mucinous adenocarcinoma__ Signet-ring cell carcinoma__ Small cell carcinoma__ Squamous cell carcinoma__ Adenosquamous carcinoma__ Medullary carcinoma__ Undifferentiated carcinoma__ Other (specify): ______ Carcinoma, type cannot be determinedHistologic Grade (note C)__ Not applicable__ Cannot be assessed__ Low grade (well differentiated to moderately differentiated)__ High grade (poorly differentiated to undifferentiated)__ Other (specify): ____*Histologic Features Suggestive of Microsatellite Instability (note I)*Intratumoral Lymphocytic Response (tumor-infiltrating lymphocytes)*__ None*__ Mild to moderate (0–2 per high-power [×400] field)*__ Marked (3 or more per high-power field)*Peritumor Lymphocytic Response (Crohn-like response)*__ None*__ Mild to moderate*__ Marked*Tumor Subtype and Differentiation (select all that apply)*__ Mucinous tumor component (specify percentage: __)*__ Medullary tumor component*__ High histologic grade (poorly differentiated)Microscopic Tumor Extension__ Cannot be assessed__ No evidence of primary tumor__ Intramucosal carcinoma, invasion of lamina propria__ Tumor invades submucosa__ Tumor invades muscularis propria__ Tumor invades through the muscularis propria into the subserosal adipose tissue or the nonperitonealized pericolic or perirectal soft tissues but does not extend to the serosal surface__ Tumor penetrates to the surface of the visceral peritoneum (serosa)__ Tumor is adherent to other organs or structures (specify: ____)__ Tumor directly invades adjacent structures (specify: ____)__ Tumor penetrates to the surface of the visceral peritoneum (serosa) and directly invades adjacent structures (specify: ____)Margins (select all that apply) (note J)Proximal Margin__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma__ Involved by invasive carcinoma__ Intramucosal carcinoma/adenoma not identified at proximal margin__ Intramucosal carcinoma/adenoma present at proximal marginDistal Margin__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma__ Involved by invasive carcinoma__ Intramucosal carcinoma/adenoma not identified at distal margin__ Intramucosal carcinoma/adenoma present at distal marginCircumferential (Radial) or Mesenteric Margin__ Not applicable__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma__ Involved by invasive carcinoma (tumor present 0– 1 mm from margin)If all margins uninvolved by invasive carcinoma: Distance of invasive carcinoma from closest margin: __ mm or __ cm Specify margin: __Lateral Margin (for noncircumferential transanal disk excision)__ Cannot be assessed__ Uninvolved by invasive carcinoma Distance of invasive carcinoma from closest lateral margin: __ mm * Specify location (eg, o'clock position), if possible: ______ Involved by invasive carcinoma * Specify location (eg, o'clock position), if possible: ______ Uninvolved by adenoma__ Involved by adenomaTreatment Effect (applicable to carcinomas treated with neoadjuvant therapy) (note K)__ No prior treatment__ Present *__ No residual tumor (complete response, grade 0) *__ Moderate response (grade 1, minimal residual cancer) *__ Minimal response (grade 2)__ No definite response identified (grade 3, poor response)__ Not knownLymph-Vascular Invasion (note E)__ Not identified__ Present__ IndeterminatePerineural Invasion (note E)__ Not identified__ Present__ IndeterminateTumor Deposits (Discontinuous Extramural Extension)(note L)__ Not identified__ Present__ Indeterminate*Type of Polyp in Which Invasive Carcinoma Arose (note F)*__ None identified*__ Tubular adenoma*__ Villous adenoma*__ Tubulovillous adenoma*__ Traditional serrated adenoma*__ Sessile serrated adenoma*__ Hamartomatous polyp*__ IndeterminatePathologic Staging (pTNM) (note M)TNM Descriptors (required only if applicable) (select all that apply)__ m (multiple primary tumors)__ r (recurrent)__ y (posttreatment)Primary Tumor (pT)__ pTX: Cannot be assessed__ pT0: No evidence of primary tumor__ pTis: Carcinoma in situ, intraepithelial (no invasion)__ pTis: Carcinoma in situ, invasion of lamina propria__ pT1: Tumor invades submucosa__ pT2: Tumor invades muscularis propria__ pT3: Tumor invades through the muscularis propria into pericolorectal tissues__ pT4a: Tumor penetrates the visceral peritoneum__ pT4b: Tumor directly invades or is adherent to other organs or structuresRegional Lymph Nodes (pN)__ pNX: Cannot be assessed__ pN0: No regional lymph node metastasis__ pN1a: Metastasis in 1 regional lymph node__ pN1b: Metastasis in 2 to 3 regional lymph nodes__ pN1c: Tumor deposit(s) in the subserosa, or nonperitonealized pericolic or perirectal tissues without regional lymph node metastasis__ pN2a: Metastasis in 4 to 6 regional lymph nodes__ pN2b: Metastasis in 7 or more regional lymph nodesSpecify: Number examined: __ Number involved: __Distant Metastasis (pM)__ Not applicable__ pM1: Distant metastasis * Specify site(s): ______ pM1a: Metastasis to single organ or site (eg, liver, lung, ovary, nonregional lymph node)__ pM1b: Metastasis to more than one organ/site or to the peritoneum*Additional Pathologic Findings (select all that apply)*__ None identified*__ Adenoma(s)*__ Chronic ulcerative proctocolitis*__ Crohn disease*__ Dysplasia arising in inflammatory bowel disease*__ Other polyps (type[s]): ____*__ Other (specify): ____*Ancillary Studies (select all that apply) (note N)*__ Microsatellite instability (specify testing method: ____) *__ Stable *__ Low *__ High* Immunohistochemistry Studies for Mismatch Repair Proteins *__ MLH1 *__ Intact nuclear positivity, tumor cells *__ Loss of nuclear positivity, tumor cells *__ Pending *__ Other (specify): ____ *__ MSH2 *__ Intact nuclear positivity, tumor cells *__ Loss of nuclear positivity, tumor cells *__ Pending *__ Other (specify): ____ *__ MSH6 *__ Intact nuclear positivity, tumor cells *__ Loss of nuclear positivity, tumor cells *__ Pending *__ Other (specify): ____ *__ PMS2 *__ Intact nuclear positivity, tumor cells *__ Loss of nuclear positivity, tumor cells *__ Pending *__ Other (specify): ____*__ BRAF V600E mutational analysis (specify testing method: ____) *__ Mutant BRAF detected *__ No mutant BRAF detected (wild-type BRAF allele) *__ Other (specify): ____*__ KRAS mutational analysis (specify testing method: ____) *__ Mutant KRAS detected (specify mutation ____) *__ No mutant KRAS detected (wild-type KRAS allele) *__ Other (specify): ____Other, specify: ____*__ Not performed*Comment(s): ____The protocol applies to all carcinomas arising in the colon and rectum.1 It excludes carcinomas of the vermiform appendix and low-grade neuroendocrine neoplasms (carcinoid tumors).The colon is divided as shown in Figure 1. The right colon is subdivided into the cecum and the ascending colon.2 The left colon is subdivided into the descending colon and sigmoid colon (see Table).1The transition from sigmoid to rectum is marked by the fusion of the tenia coli of the sigmoid to form the circumferential longitudinal muscle of the rectal wall approximately 12 to 15 cm from the dentate line. The rectum is defined clinically as the distal large intestine commencing opposite the sacral promontory and ending at the anorectal ring, which corresponds to the proximal border of the puborectalis muscle palpable on digital rectal examination1 (Figure 2). When measuring below with a rigid sigmoidoscope, it extends 16 cm from the anal verge.Tumors located at the border between 2 subsites of the colon (eg, cecum and ascending colon) are registered as tumors of the subsite that is more involved. If 2 subsites are involved to the same extent, the tumor is classified as an “overlapping” lesion.A tumor is classified as rectal if its inferior margin lies less than 16 cm from the anal verge or if any part of the tumor is located at least partly within the supply of the superior rectal artery.3 A tumor is classified as rectosigmoid when differentiation between rectum and sigmoid according to the previously mentioned guidelines is not possible.4For consistency in reporting, the histologic classification proposed by the World Health Organization (WHO) is recommended and follows.5AdenocarcinomaMucinous (colloid) adenocarcinoma (greater than 50% mucinous)Signet-ring cell carcinoma (greater than 50% signet-ring cells)*Squamous cell carcinomaAdenosquamous carcinomaMedullary carcinoma†Small cell carcinoma# (high-grade neuroendocrine carcinoma)Undifferentiated carcinoma*Other (specify)‡* By convention, signet-ring cell carcinomas, small cell carcinomas, and undifferentiated carcinomas are high grade (see note C). The only histologic types of colorectal carcinoma that have been shown to have adverse prognostic significance independent of stage are signet-ring cell carcinoma6 and small cell carcinoma (high-grade neuroendocrine carcinoma).7† Medullary carcinoma is a distinctive histologic type strongly associated with high levels of microsatellite instability (MSI-H), indicative of defects in normal DNA repair gene function. Medullary carcinoma may occur either sporadically8 or in association with hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC).9 This tumor type is characterized by solid growth in nested, organoid, or trabecular patterns, with no immunohistochemical evidence of neuroendocrine differentiation. Medullary carcinomas are also characterized by numerous tumor infiltrating lymphocytes (see note I).‡ The term “carcinoma, NOS” (not otherwise specified) is not part of the WHO classification.A number of grading systems for colorectal cancer have been suggested, but a single widely accepted and uniformly used standard for grading is lacking. Most systems stratify tumors into 3 or 4 grades as follows:Grade 1: Well differentiatedGrade 2: Moderately differentiatedGrade 3: Poorly differentiatedGrade 4: UndifferentiatedDespite a significant degree of interobserver variability,10 histologic grade has repeatedly been shown by multivariate analysis to be a stage-independent prognostic factor.11 Specifically, it has been demonstrated that high tumor grade is an adverse prognostic factor. It is noteworthy that in most studies documenting the prognostic power of tumor grade, the number of grades has been collapsed to produce a 2-tiered stratification for data analysis as follows:Low grade: Well differentiated and moderately differentiatedHigh grade: Poorly differentiated and undifferentiatedThe widest variations in grading concern the stratification of low-grade tumors into well- or moderately differentiated categories, while interobserver variability in diagnosing high-grade carcinoma is relatively small. Therefore, in light of its proven prognostic value, relative simplicity, and reproducibility, a 2-tiered grading system for colorectal carcinoma (ie, low grade and high grade) is recommended. The following criteria for grading based on gland formation alone are suggested12:Low grade: Greater than or equal to 50% gland formationHigh grade: Less than 50% gland formationColorectal adenomas containing invasive adenocarcinoma that extends through the muscularis mucosae into the submucosa have been defined as “malignant polyps.”13 This term encompasses cases in which the entire polyp head is replaced by carcinoma and adenomas with focal malignancy, but the definition excludes adenomas with high-grade dysplasia (intraepithelial carcinoma) or intramucosal carcinoma (invasive carcinoma limited to the lamina propria or invading no deeper than the muscularis mucosae) because these polyps possess negligible biologic potential for metastasis14 (see Tis in note M).Malignant polyps removed by endoscopic polypectomy require evaluation of histologic factors related to the risk of adverse outcome (ie, lymph node metastasis or local recurrence from residual malignancy) following polypectomy.1315 Factors shown to have independent prognostic significance and are important in determining the need for further surgical treatment include:An increased risk of adverse outcome has been shown to be associated with:Venous invasion has been demonstrated by multivariate analysis to be an independent adverse prognostic factor.11 Invasion of extramural veins, in particular, has been shown to be an independent indicator of unfavorable outcome and increased risk of occurrence of hepatic metastasis.16 The significance of intramural venous invasion is less clear, because data specific to this issue are lacking.In several studies, both lymphatic invasion17 and perineural invasion18 have been shown by multivariate analysis to be independent indicators of poor prognosis. The prognostic significance, if any, of the anatomic location of these structures is not defined. Furthermore, it is not always possible to distinguish lymphatic vessels from postcapillary venules because both are small, thin-walled structures. Thus, the presence or absence of tumor invasion of small, thin-walled vessels should be reported in all cases.Distinction should be made between traditional serrated adenomas, which exhibit cytologic features of adenomas, and the newly described sessile serrated adenomas.19 The sessile serrated adenoma may be the precursor lesion for colorectal carcinomas with MSI-H; they are more commonly found in the right colon and are characterized by serrated architecture with bulbous dilatation of deep crypts and lack of overt nuclear atypia, in most cases.Tumor perforation is an uncommon complication of colorectal cancer, but one that is associated with a poor outcome, including high in-hospital mortality and morbidity.20 Perforation of the uninvolved colon proximal to an obstructing tumor is also associated with high mortality because of generalized peritonitis and sepsis. Reported perforation rates range from 2.6% to 9%. Perforation is more likely to occur in older patients.The quality of the surgical technique is a key factor in the success of surgical treatment for rectal cancer, both in the prevention of local recurrence and in long-term survival. Numerous studies have demonstrated that total mesorectal excision (TME) improves local recurrence rates and the corresponding survival by as much as 20%. This surgical technique entails precise sharp dissection within the areolar plane outside (lateral to) the visceral mesorectal fascia to remove the rectum. This plane encases the rectum, its mesentery, and all regional nodes and constitutes Waldeyer fascia. High-quality TME surgery reduces local recurrence from 20% to 30%, to 8% to 10% or less, and increases 5-year survival from 48% to 68%.2122 Adjuvant therapy in the presence of a high-quality TME may further reduce local recurrence (from 8% to 2.6%).22Pathologic evaluation of the resection specimen has been shown to be a sensitive means of assessing the quality of rectal surgery. It is superior to indirect measures of surgical quality assessment, such as perioperative mortality, rates of complication, number of local recurrences, and 5-year survival. It has been shown that macroscopic pathologic assessment of the completeness of the mesorectum of the specimen, scored as complete, partially complete, or incomplete, accurately predicts both local recurrence and distant metastasis.22 Microscopic parameters, such as the status of the circumferential resection margin, the distance between the tumor and nearest circumferential margin (ie, “surgical clearance”), and the distance between the tumor and the closest distal margin, are all important predictors of local recurrence and may be affected by surgical technique. There is strong evidence that the status of the circumferential resection margin is a powerful predictor of local recurrence but is inconsistently evaluated and underreported.The nonperitonealized surface of the fresh specimen is examined circumferentially, and the completeness of the mesorectum is scored as described in the following.22 The entire specimen is scored according to the worst area.Little bulk to the mesorectumDefects in the mesorectum down to the muscularis propriaAfter transverse sectioning, the circumferential margin appears very irregularModerate bulk to the mesorectumIrregularity of the mesorectal surface with defects greater than 5 mm, but none extending to the muscularis propriaNo areas of visibility of the muscularis propria except at the insertion site of the levator ani musclesIntact bulky mesorectum with a smooth surfaceOnly minor irregularities of the mesorectal surfaceNo surface defects greater than 5 mm in depthNo coning toward the distal margin of the specimenAfter transverse sectioning, the circumferential margin appears smoothIdentification of MSI-H colorectal tumors is important, as mismatch repair deficiency may serve as a prognostic marker of patient outcome, a predictive marker of response to chemotherapy, and as a screening tool for HNPCC (Lynch Syndrome). Revised Bethesda guidelines for HNPCC detection recommend testing colorectal tumors for MSI under the following circumstances23:1. Colorectal cancer diagnosed in a patient who is younger than 50 years2. Presence of synchronous, metachronous, or other HNPCC-associated tumors (endometrial, stomach, ovarian, pancreas, ureter and renal pelvis, biliary tract, small bowel, and brain tumors and sebaceous adenomas and keratoacanthomas), regardless of age3. Colorectal cancer with MSI-H histology† in a patient who is younger than 60 years4. Colorectal cancer in 1 or more first-degree relatives with an HNPCC-related tumor, with 1 of the cancers being diagnosed in a person younger than 50 years5. Colorectal cancer diagnosed in 2 or more first- or second-degree relatives with HNPCC-related tumors, regardless of age† MSI-H histologic features are defined as presence of tumor-infiltrating lymphocytes, Crohn-like lymphocytic reaction, mucinous/signet-ring cell differentiation, or medullary growth pattern.23Tumor-infiltrating lymphocytes are closely associated with MSI and medullary architecture (see previous) and should be distinguished from Crohn-like peritumoral infiltrates (lymphoid aggregated or follicles are the tumor edge, not associated with preexisting lymph node).24 Although absolute cutoff values have not been established, only moderate- and high-density intratumoral lymphocytes (approximately 3 or more per high-power field using hematoxylin-eosin–stained sections) should be considered significant.25Other pathologic features associated with MSI-H status in colorectal carcinomas include right-sided location, high-grade histology, and lack of dirty necrosis.25It may be helpful to mark the margin(s) closest to the tumor with ink following close examination of the serosal surface for puckering and other signs of tumor involvement. Margins marked by ink should be designated in the macroscopic description of the surgical pathology report. The serosal surface (visceral peritoneum) does not constitute a surgical margin.In addition to addressing the proximal and distal margins, the circumferential (radial) margin (Figure 3, A through C) must be assessed for any segment either unencased (Figure 3, C) or incompletely encased by peritoneum (Figure 3, B) (see note A). The circumferential (radial) margin represents the adventitial soft tissue margin closest to the deepest penetration of tumor and is created surgically by blunt or sharp dissection of the retroperitoneal or subperitoneal aspect, respectively. Multivariate analysis has suggested that tumor involvement of the circumferential (radial) margin is the most critical factor in predicting local recurrence in rectal cancer.26 A positive circumferential (radial) margin in rectal cancer increases the risk of recurrence by 3.5-fold and doubles the risk of death from disease. For this reason, the circumferential (radial) margin should be assessed in all rectal carcinomas as well as colonic segments with nonperitonealized surfaces. The distance between the tumor and circumferential (radial) margin should be reported (see note H). The circumferential (radial) margin is considered negative if the tumor is more than 1 mm from the inked nonperitonealized surface but should be recorded as positive if tumor is located 1 mm or less from the nonperitonealized surface because local recurrence rates are similar with clearances of 0 to 1 mm. This assessment includes tumor within a lymph node as well as direct tumor extension, but if circumferential margin positivity is based solely on intranodal tumor, this should be so stated.The mesenteric resection margin is the only relevant circumferential margin in segments completely encased by peritoneum (eg, transverse colon). Involvement of this margin should be reported even if tumor does not penetrate the serosal surface.Sections to evaluate the proximal and distal resection margins can be obtained either by longitudinal sections perpendicular to the margin or by en face sections parallel to the margin. The distance from the tumor edge to the closest resection margin(s) may also be important, particularly for low anterior resections. For these cases, a distal resection margin of 2 cm is considered adequate; for T1 and T2 tumors, 1 cm may be sufficient distal clearance. Anastomotic recurrences are rare when the distance to the closest transverse margin is 5 cm or greater.In cases of carcinoma arising in a background of inflammatory bowel disease, proximal and distal resection margins should be evaluated for dysplasia and active inflammation.Neoadjuvant chemoradiation therapy in rectal cancer is associated with significant tumor response and downstaging.27 Because eradication of the tumor, as detected by pathologic examination of the resected specimen, is associated with a significantly better prognosis,28 specimens from patients receiving neoadjuvant chemoradiation should be thoroughly sectioned, with careful examination of the tumor site. Minimal residual disease has been shown to have a better prognosis than gross residual disease.28 Although several grading systems for tumor response have been advocated, a 3-point tumor regression grade has been shown to provide good interobserver reproducibility compared with 5-grade schemas, and to provide similar prognostic significance.29Tumor regression should be assessed only in the primary tumor; lymph node metastases should not be included in the assessment.Acellular pools of mucin in specimens from patient receiving neoadjuvant therapy are considered to represent completely eradicated tumor and are not used to assign pT stage or counted as positive lymph nodes.Irregular discrete tumor deposits in pericolic or perirectal fat away from the leading edge of the tumor and showing no evidence of residual lymph node tissue, but within the lymphatic drainage of the primary carcinoma, are considered peritumoral deposits or satellite nodules1 and are not counted as lymph nodes replaced by tumor. Most examples are due to lymphovascular or, more rarely, perineural invasion. Because these tumor deposits are associated with reduced disease-free and overall survival,3031 their number should be recorded in the surgical pathology report. If tumor deposits are observed in lesions that would otherwise be classified as pT1 (tumor confined to submucosa) or pT2 (tumor confined to muscularis propria), then the primary tumor classification is not changed, but the nodule is recorded in a separate N category as N1c1 (see note M).Surgical resection remains the most effective therapy for colorectal carcinoma, and the best estimation of prognosis is derived from the pathologic findings on the resection specimen. The anatomic extent of disease is by far the most important prognostic factor in colorectal cancer.The protocol recommends the TNM staging system of the AJCC and the UICC1 but does not preclude the use of other staging systems.By AJCC/UICC convention, the designation “T” refers to a primary tumor that has not been previously treated. The symbol “p” refers to the pathologic classification of the TNM, as opposed to the clinical classification, and is based on gross and microscopic examination. pT entails a resection of the primary tumor or biopsy adequate to evaluate the highest pT category, pN entails removal or biopsy of nodes adequate to validate lymph node metastasis, and pM implies microscopic examination of distant lesions. Clinical classification (cTNM) is usually carried out by the referring physician before treatment during initial evaluation of the patient or when pathologic classification is not possible.For identification of special cases of TNM or pTNM classifications, the “m” suffix and “y” and “r” prefixes are u