Temperature controls plant growth and development, and climate change has already altered the phenology of wild plants and crops1. However, the mechanisms by which plants sense temperature are not well understood. The evening complex is a major signalling hub and a core component of the plant circadian clock2,3. The evening complex acts as a temperature-responsive transcriptional repressor, providing rhythmicity and temperature responsiveness to growth through unknown mechanisms2,4-6. The evening complex consists of EARLY FLOWERING 3 (ELF3)4,7, a large scaffold protein and key component of temperature sensing; ELF4, a small α-helical protein; and LUX ARRYTHMO (LUX), a DNA-binding protein required to recruit the evening complex to transcriptional targets. ELF3 contains a polyglutamine (polyQ) repeat8-10, embedded within a predicted prion domain (PrD). Here we find that the length of the polyQ repeat correlates with thermal responsiveness. We show that ELF3 proteins in plants from hotter climates, with no detectable PrD, are active at high temperatures, and lack thermal responsiveness. The temperature sensitivity of ELF3 is also modulated by the levels of ELF4, indicating that ELF4 can stabilize the function of ELF3. In both Arabidopsis and a heterologous system, ELF3 fused with green fluorescent protein forms speckles within minutes in response to higher temperatures, in a PrD-dependent manner. A purified fragment encompassing the ELF3 PrD reversibly forms liquid droplets in response to increasing temperatures in vitro, indicating that these properties reflect a direct biophysical response conferred by the PrD. The ability of temperature to rapidly shift ELF3 between active and inactive states via phase transition represents a previously unknown thermosensory mechanism.

Many proteins with intrinsically disordered regions undergo liquid-liquid phase separation under specific conditions in vitro and in vivo. These complex biopolymers form a metastable phase with distinct mechanical properties defining the timescale of their biological functions. However, determining these properties is nontrivial, even in vitro, and often requires multiple techniques. Here we report the measurement of both viscosity and surface tension of biomolecular condensates via correlative fluorescence microscopy and atomic force microscopy (AFM) in a single experiment (fluorescence recovery after probe-induced dewetting, FRAP-ID). Upon surface tension evaluation via regular AFM-force spectroscopy, controlled AFM indentations induce dry spots in fluorescent condensates on a glass coverslip. The subsequent rewetting exhibits a contact line velocity that is used to quantify the condensed-phase viscosity. Therefore, in contrast with fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), where molecular diffusion is observed, in FRAP-ID fluorescence recovery is obtained through fluid rewetting and the subsequent morphological relaxation. We show that the latter can be used to cross-validate viscosity values determined during the rewetting regime. Making use of fluid mechanics, FRAP-ID is a valuable tool to evaluate the mechanical properties that govern the dynamics of biomolecular condensates and determine how these properties impact the temporal aspects of condensate functionality.

Abstract The year 2022 was marked by the mpox outbreak caused by human monkeypox virus (MPXV), which is about 98 % identical to vaccinia virus (VACV) at the sequence level regarding the proteins involved in DNA replication. We present the strategy for the production of the VACV DNA polymerase holoenzyme composed of the E9 polymerase associated with its co-factor, the A20-D4 heterodimer, which led to the 3.8 Å cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the DNA-free form of the holoenzyme. Model building used high-resolution structures of components of the complex and the A20 structure predicted by AlphaFold 2. The structure of E9 does not change in context of the holoenzyme compared to the crystal structure. As for the MPXV holoenzyme, a contact between E9 and D4 is mediated by a cluster of hydrophobic residues. The holoenzyme structure is quite compact and surprisingly similar to the MPXV holoenzyme in presence of a DNA template, with the exception of a movement of the finger domain and the thumb domain, which becomes ordered in presence of DNA. Even in absence of DNA, the VACV holoenzyme structure is too compact for an agreement with SAXS data. This suggests the presence of more open conformations in solution, which are also predicted by Alphafold 2 indicating hinge regions located within A20. Using biolayer interferometry we showed that indeed, the E9-D4 interaction is weak and transient although very important as it has not been possible to obtain viable viruses carrying mutations of key residues in the E9-D4 interface. Author Summary The 2022 outbreak of mpox is caused by monkeypox virus closely related to the best studied model, vaccinia virus. Genome replication, which takes place largely autonomously in the cytosol of the infected cell, is still not really understood. Viral DNA synthesis involves a DNA repair enzyme, the uracil-DNA glycosylase D4 linked to the structural protein A20 forming the processivity factor, which in turn binds to E9 forming the complex required for processive DNA synthesis. Here we present the first structure of the vaccinia virus polymerase holoenzyme E9-A20-D4 at 3.8 Å obtained by cryo-electron microscopy. This structure, together with several recent structures from monkeypox virus, provide a static view of the complex with a previously undescribed contact between E9 and D4. Our small-angle scattering data show that other conformations, taking advantage of 2 hinge regions in A20, exist in solution. Using site-directed mutagenesis and binding studies we show that the contact between E9 and D4, which serves to encircle the template strand, is important, but transient. Thus the current model of the orientation of the holoenzyme on the replication fork may not be the only one possible.

Cold stress is one of the major abiotic stress factors affecting rice growth and development, leading to significant yield loss in the context of global climate change. Exploring natural variants that confer cold resistance and the underlying molecular mechanism responsible for this is the major strategy to breed cold tolerant rice varieties. Here, we show that the natural variations of a SIMILAR to RCD ONE (SRO) gene, OsSRO1c, confer cold tolerance in rice at both seedling and booting stages. OsSRO1c possesses intrinsic liquid-liquid phase separation ability in vivo and in vitro and recruits an AP2/ERF transcription factor and positive cold stress regulator, OsDREB2B, into its biomolecular condensates in the nucleus, resulting in elevated transcriptional activity of OsDREB2B. The OsSRO1c-OsDREB2B complex directly responds to low temperature through dynamic phase transitions and regulates key cold response genes, including COLD1. Furthermore, introgression of an elite haplotype of OsSRO1c into a cold susceptible indica rice significantly increases its cold resistance. Collectively, our work reveals a novel cold tolerance regulatory module in rice and provides promising genetic targets for molecular breeding of cold-tolerant rice varieties.

Abstract Liquid-liquid phase separation (LLPS) is an important mechanism enabling the dynamic compartmentalisation of macromolecules, including complex polymers such as proteins and nucleic acids, and occurs as a function of the physicochemical environment. In the model plant, Arabidopsis thaliana , LLPS by the protein EARLY FLOWERING3 (ELF3) occurs in a temperature sensitive manner and controls thermoresponsive growth. ELF3 contains a largely unstructured prion-like domain (PrLD) that acts as a driver of LLPS in vivo and in vitro. The PrLD contains a poly-glutamine (polyQ) tract, whose length varies across natural Arabidopsis accessions. Here, we use a combination of biochemical, biophysical and structural techniques to investigate the dilute and condensed phases of the ELF3 PrLD with varying polyQ lengths. We demonstrate that the dilute phase of the ELF3 PrLD forms a monodisperse higher order oligomer that does not depend on the presence of the polyQ sequence. This species undergoes LLPS in a pH and temperature-sensitive manner and the polyQ region of the protein tunes the initial stages of phase separation. The liquid phase rapidly undergoes aging and forms a hydrogel as shown by fluorescence and atomic force microscopies. Furthermore, we demonstrate that the hydrogel assumes a semi-ordered structure as determined by small angle X-ray scattering, electron microscopy and X-ray diffraction. These experiments demonstrate a rich structural landscape for a PrLD protein and provide a framework to describe the structural and biophysical properties of biomolecular condensates.