The Arp2/3 complex generates branched actin networks when activated by Nucleation Promoting Factors (NPFs). Recently, the WASH family of NPFs has been identified, but its cellular role is unclear. Here, we show that WASH generates an actin network on a restricted domain of sorting and recycling endosomes. We found that WASH belongs to a multiprotein complex containing seven subunits, including the heterodimer of capping protein (CP). In vitro, the purified WASH complex activates Arp2/3-mediated actin nucleation and binds directly to liposomes. WASH also interacts with dynamin. WASH depletion gives rise to long membrane tubules pulled out from endosomes along microtubules, as does dynamin inhibition. Accordingly, WASH is required for efficient transferrin recycling. Together, these data suggest that the WASH molecular machine, integrating CP with a NPF, controls the fission of endosomes through an interplay between the forces generated by microtubule motors and actin polymerization.

Neural organoids have the potential to improve our understanding of human brain development and neurological disorders. However, it remains to be seen whether these tissues can model circuit formation with functional neuronal output. Here we have adapted air-liquid interface culture to cerebral organoids, leading to improved neuronal survival and axon outgrowth. The resulting thick axon tracts display various morphologies, including long-range projection within and away from the organoid, growth-cone turning, and decussation. Single-cell RNA sequencing reveals various cortical neuronal identities, and retrograde tracing demonstrates tract morphologies that match proper molecular identities. These cultures exhibit active neuronal networks, and subcortical projecting tracts can innervate mouse spinal cord explants and evoke contractions of adjacent muscle in a manner dependent on intact organoid-derived innervating tracts. Overall, these results reveal a remarkable self-organization of corticofugal and callosal tracts with a functional output, providing new opportunities to examine relevant aspects of human CNS development and disease.

Cells and organelles are delimited by lipid bilayers in which high deformability is essential to many cell processes, including motility, endocytosis and cell division. Membrane tension is therefore a major regulator of the cell processes that remodel membranes, albeit one that is very hard to measure in vivo. Here we show that a planarizable push-pull fluorescent probe called FliptR (fluorescent lipid tension reporter) can monitor changes in membrane tension by changing its fluorescence lifetime as a function of the twist between its fluorescent groups. The fluorescence lifetime depends linearly on membrane tension within cells, enabling an easy quantification of membrane tension by fluorescence lifetime imaging microscopy. We further show, using model membranes, that this linear dependency between lifetime of the probe and membrane tension relies on a membrane-tension-dependent lipid phase separation. We also provide calibration curves that enable accurate measurement of membrane tension using fluorescence lifetime imaging microscopy.

Cell-permeable DNA stains are popular markers in live-cell imaging. Currently used DNA stains for live-cell imaging are either toxic, require illumination with blue light or are not compatible with super-resolution microscopy, thereby limiting their utility. Here we describe a far-red DNA stain, SiR-Hoechst, which displays minimal toxicity, is applicable in different cell types and tissues, and is compatible with super-resolution microscopy. The combination of these properties makes this probe a powerful tool for live-cell imaging.

In this report, "fluorescent flippers" are introduced to create planarizable push–pull probes with the mechanosensitivity and fluorescence lifetime needed for practical use in biology. Twisted push–pull scaffolds with large and bright dithienothiophenes and their S,S-dioxides as the first "fluorescent flippers" are shown to report on the lateral organization of lipid bilayers with quantum yields above 80% and lifetimes above 4 ns. Their planarization in liquid-ordered (Lo) and solid-ordered (So) membranes results in red shifts in excitation of up to +80 nm that can be transcribed into red shifts in emission of up to +140 nm by Förster resonance energy transfer (FRET). These unique properties are compatible with multidomain imaging in giant unilamellar vesicles (GUVs) and cells by confocal laser scanning or fluorescence lifetime imaging microscopy. Controls indicate that strong push–pull macrodipoles are important, operational probes do not relocate in response to lateral membrane reorganization, and two flippers are indeed needed to "really swim," i.e., achieve high mechanosensitivity.

Microtubules are dynamic polymers that are used for intracellular transport and chromosome segregation during cell division. Their instability stems from the low energy of tubulin dimer interactions, which sets the growing polymer close to its disassembly conditions. Microtubules function in coordination with kinesin and dynein molecular motors, which use ATP hydrolysis to produce mechanical work and move on microtubules. This raises the possibility that the forces produced by walking motors can break dimer interactions and trigger microtubule disassembly. We tested this hypothesis by studying the interplay between microtubules and moving molecular motors in vitro. Our results show that the mechanical work of molecular motors can remove tubulin dimers from the lattice and rapidly destroy microtubules. This effect was not observed when free tubulin dimers were present in the assay. Using fluorescently labelled tubulin dimers we found that dimer removal by motors was compensated for by the insertion of free tubulin dimers into the microtubule lattice. This self-repair mechanism allows microtubules to survive the damage induced by molecular motors as they move along their tracks. Our study reveals the existence of coupling between the motion of kinesin and dynein motors and the renewal of the microtubule lattice.

Abstract Optimum protein function and biochemical activity critically depends on water availability because solvent thermodynamics drive protein folding and macromolecular interactions 1 . Reciprocally, macromolecules restrict the movement of ‘structured’ water molecules within their hydration layers, reducing the available ‘free’ bulk solvent and therefore the total thermodynamic potential energy of water, or water potential. Here, within concentrated macromolecular solutions such as the cytosol, we found that modest changes in temperature greatly affect the water potential, and are counteracted by opposing changes in osmotic strength. This duality of temperature and osmotic strength enables simple manipulations of solvent thermodynamics to prevent cell death after extreme cold or heat shock. Physiologically, cells must sustain their activity against fluctuating temperature, pressure and osmotic strength, which impact water availability within seconds. Yet, established mechanisms of water homeostasis act over much slower timescales 2,3 ; we therefore postulated the existence of a rapid compensatory response. We find that this function is performed by water potential-driven changes in macromolecular assembly, particularly biomolecular condensation of intrinsically disordered proteins. The formation and dissolution of biomolecular condensates liberates and captures free water, respectively, quickly counteracting thermal or osmotic perturbations of water potential, which is consequently robustly buffered in the cytoplasm. Our results indicate that biomolecular condensation constitutes an intrinsic biophysical feedback response that rapidly compensates for intracellular osmotic and thermal fluctuations. We suggest that preserving water availability within the concentrated cytosol is an overlooked evolutionary driver of protein (dis)order and function.

Abstract Between 6-20% of the cellular proteome is under circadian control to tune cell function with cycles of environmental change. For cell viability, and to maintain volume within narrow limits, the osmotic pressure exerted by changes in the soluble proteome must be compensated. The mechanisms and consequences underlying compensation are not known. Here, we show in cultured mammalian cells and in vivo that compensation requires electroneutral active transport of Na + , K + , and Cl − through differential activity of SLC12A family cotransporters. In cardiomyocytes ex vivo and in vivo , compensatory ion fluxes alter their electrical activity at different times of the day. Perturbation of soluble protein abundance has commensurate effects on ion composition and cellular function across the circadian cycle. Thus, circadian regulation of the proteome impacts ion homeostasis with substantial consequences for the physiology of electrically active cells such as cardiomyocytes.

Summary Protein filaments are used in myriads of ways to organise other molecules in space and time within cells. Some filament-forming proteins couple the hydrolysis of nucleotides to their polymerisation cycle, thus powering the directed movement of other molecules. These filaments are termed cytomotive. Only members of the actin and tubulin protein superfamilies are known to form cytomotive filaments. We sought to examine the basis of cytomotivity via structural studies of the polymerisation cycles of actin and tubulin homologues from across the tree of life. We analysed published data and performed new structural experiments designed to disentangle functional components of these complex filament systems. In sum, our analysis demonstrates the existence of shared subunit polymerisation switches amongst both cytomotive actins and tubulins, i.e. the conformation of subunits switches upon assembly into filaments. Such cytomotive switches explain filament robustness, by enabling the coupling of kinetic and structural polarities required for useful cytomotive behaviours, and by ensuring that single cytomotive filaments do not fall apart.