Summary PspA is the main effector of the phage shock protein (Psp) system and preserves the bacterial inner membrane integrity and function. Here, we present the 3.6 Å resolution cryo-EM structure of PspA assembled in helical rods. PspA monomers adopt a canonical ESCRT-III fold in an extended open conformation. PspA rods are capable of enclosing lipids and generate positive membrane curvature. Using cryo-EM we visualized how PspA remodels membrane vesicles into μm-sized structures and how it mediates the formation of internalized vesicular structures. Hot spots of these activities are zones derived from PspA assemblies, serving as lipid transfer platforms and linking previously separated lipid structures. These membrane fusion and fission activities are in line with the described functional properties of bacterial PspA/IM30/LiaH proteins. Our structural and functional analyses reveal that bacterial PspA belongs to the evolutionary ancestry of ESCRT-III proteins involved in membrane remodeling.

Gas vesicles allow a diverse group of bacteria and archaea to move in the water column by controlling their buoyancy (1). These gas-filled cellular nanocompartments are formed by up to micrometers long protein shells that are permeable only to gas. The molecular basis of their unique properties and mechanism of assembly remains unknown. Here, we solve the 3.2 Å cryo-EM structure of the B . megaterium gas vesicle shell made from the structural protein GvpA that self-assembles into hollow helical cylinders closed off by cone-shaped tips. Remarkably, the unique fold adopted by GvpA generates a corrugated cylinder surface typically found in force-bearing thin-walled structures. We identified pores in the vesicle wall that enable gas molecules to freely diffuse in and out of the GV shell, while the exceptionally hydrophobic interior surface effectively repels water. Our results show that gas vesicles consist of two helical half-shells connected through a unique arrangement of GvpA monomers, suggesting a mechanism of gas vesicle biogenesis. Comparative structural analysis confirms the evolutionary conservation of gas vesicle assemblies and reveals molecular details of how the secondary structural protein GvpC reinforces the GvpA shell. Our findings provide a structural framework that will further research into the biology of gas vesicles, and enable rational molecular engineering to harness their unique properties for acoustic imaging (2, 3).

p62/SQSTM1 is an autophagy receptor and signaling adaptor with an N-terminal PB1 domain that forms the scaffold of phase-separated p62 bodies in the cell. The molecular determinants that govern PB1 domain filament formation in vitro remain to be determined and the role of p62 filaments inside the cell is currently unclear. We determined four high-resolution cryo-EM structures of different human and Arabidopsis PB1 domain assemblies and observed a filamentous ultrastructure of phase-separated p62/SQSTM1 bodies using correlative cellular EM. We show that oligomerization or polymerization, driven by a double arginine finger in the PB1 domain, is a general requirement for lysosomal targeting of p62. Furthermore, the filamentous assembly state of p62 is required for autophagosomal processing of the p62-specific cargo KEAP1. Our results show that using such mechanisms, p62 filaments can be critical for cargo recognition and are an integral part of phase separated p62 bodies.

Guanylate-Binding Proteins (GBPs) are interferon-inducible guanosine triphosphate hydrolases (GTPases) that mediate immune effector functions against intracellular pathogens. A key step for the antimicrobial activity of GBPs is the formation of homo- and heterooligomeric complexes on the membrane of pathogen-associated compartments or cytosolinvasive bacteria. Similar to other large GTPases of the dynamin family, oligomerisation and membrane association of GBPs depend on their GTPase activity. How nucleotide binding and hydrolysis prime GBPs for membrane targeting and coatomer formation remains unclear. Here, we report the cryo-EM structure of the full-length human GBP1 dimer in its guanine nucleotide-bound state and resolve the molecular ultrastructure of GBP1 coatomer assemblies on liposomes and bacterial lipopolysaccharide membranes. We show how nucleotide binding promotes large-scale conformational changes of the middle and GTPase effector domains that expose the isoprenylated carboxyl-terminus for association with lipid membranes. Our structure reveals how the α-helical stalks of the middle domain form a parallel arrangement firmly held in a unique cross-over arrangement by intermolecular contacts between adjacent monomers. This conformation is critical for GBP1 dimers to assemble into densely packed coatomers on target membranes. The extended α-helix of the effector domain is flexible and permits intercalation into the dense lipopolysaccharide layer on the outer membrane of gram-negative bacterial pathogens. We show that nucleotide-dependent oligomerisation and GTP hydrolysis yield GBP1 membrane scaffolds with contractile abilities that promote the formation of tubular membrane protrusions and membrane fragmentation. Collectively, our data provide a structural and mechanistic framework for interrogating the molecular basis for GBP1 effector functions in intracellular immunity.

Abstract Antimicrobial resistance represents a major threat to human health and Pseudomonas aeruginosa stands out among the pathogens responsible for this emergency. The SOS response to DNA damage plays a pivotal role in bacterial evolution, driving the development of resistance mechanisms and influencing the adaptability of bacterial populations to challenging environments, particularly in the context of antibiotic exposure. Recombinase A (RecA) and the transcriptional repressor LexA are the key players that orchestrate this process, determining either the silencing or the active transcription of the genes under their control. By integrating state-of-the-art structural approaches with binding and functional assays in vitro , we elucidated the molecular events governing the SOS response activation in P. aeruginosa , focusing on the RecA-LexA interaction. Our findings identify the conserved determinants and strength of the interactions that let RecA trigger the autocleavage and inactivation of the LexA repressor. These results provide the groundwork for designing novel antimicrobial strategies and for exploring the potential translation of Escherichia coli -derived approaches, to address the health-threatening implications of bacterial infections. Graphical Abstract

A high-density microelectrode arrays (HDMEA) with 3,150 electrodes per square millimetre was used to capture neuronal activity across various scales, including axons, dendrites, and networks. We present a new method for high-throughput segmentation of axons based on the spatial smoothness of signal delays. Comparison with both ground truth and receiver operator characteristics shows that the new segmentation method outperforms previous methods based on the signal-amplitude-to-noise ratio. Structural and functional neuronal network connectivity were reconstructed using a common extension of “Peter's rule” and a inter-spike histogram method, respectively. Approximately one third of these connections are putative chemical synapses. We evaluated the spike patterns but did not find evidence for “polychronisation” (non-synchronous but precisely timed spike sequences). The developed framework can be used to investigate the relationship between the topology of neuronal connections and emerging temporal spike patterns observed in dissociated neuronal cultures.

Cryogenic electron microscopy has become an essential tool for structure determination of biological macromolecules. In practice, the difficulty to reliably prepare samples with uniform ice thickness still represents a barrier for routine high-resolution imaging and limits the current throughput of the technique. We show that a nanofluidic sample support with well-defined geometry can be used to prepare cryo-EM specimens with reproducible ice thickness from picoliter sample volumes. The sample solution is contained in electron-transparent nanochannels that provide uniform thickness gradients without further optimisation and eliminate the potentially destructive air-water interface. We demonstrate the possibility to perform high-resolution structure determination with three standard protein specimens. Nanofabricated sample supports bear potential to automate the cryo-EM workflow, and to explore new frontiers for cryo-EM applications such as time-resolved imaging and high-throughput screening.