A comprehensive monitoring of a broad set of antibiotics in the final effluent of wastewater treatment plants (WWTPs) of 7 European countries (Portugal, Spain, Ireland, Cyprus, Germany, Finland, and Norway) was carried out in two consecutive years (2015 and 2016). This is the first study of this kind performed at an international level. Within the 53 antibiotics monitored 17 were detected at least once in the final effluent of the WWTPs, i.e.: ciprofloxacin, ofloxacin, enrofloxacin, orbifloxacin, azithromycin, clarithromycin, sulfapyridine, sulfamethoxazole, trimethoprim, nalidixic acid, pipemidic acid, oxolinic acid, cefalexin, clindamycin, metronidazole, ampicillin, and tetracycline. The countries exhibiting the highest effluent average concentrations of antibiotics were Ireland and the southern countries Portugal and Spain, whereas the northern countries (Norway, Finland and Germany) and Cyprus exhibited lower total concentration. The antibiotic occurrence data in the final effluents were used for the assessment of their impact on the aquatic environment. Both, environmental predicted no effect concentration (PNEC-ENVs) and the PNECs based on minimal inhibitory concentrations (PNEC-MICs) were considered for the evaluation of the impact on microbial communities in aquatic systems and on the evolution of antibiotic resistance, respectively. Based on this analysis, three compounds, ciprofloxacin, azithromycin and cefalexin are proposed as markers of antibiotic pollution, as they could occasionally pose a risk to the environment. Integrated studies like this are crucial to map the impact of antibiotic pollution and to provide the basis for designing water quality and environmental risk in regular water monitoring programs.

The antibiotic resistome in European UWTPs mirrors the gradient of north-to-south clinical antibiotic resistance prevalence.

REVIEW article Front. Microbiol., 14 May 2013Sec. Antimicrobials, Resistance and Chemotherapy Volume 4 - 2013 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00096

Abstract Background In the environment, microbial communities are constantly exposed to invasion by antimicrobial resistant bacteria (ARB) and their associated antimicrobial resistance genes (ARGs) that were enriched in the anthroposphere. A successful invader has to overcome the biotic resilience of the habitat, which is more difficult with increasing biodiversity. The capacity to exploit resources in a given habitat is enhanced when communities exhibit greater diversity, reducing opportunities for invaders, leading to a lower persistence. In the context of antimicrobial resistance (AMR) dissemination, exogenous ARB reaching a natural community may persist longer if the biodiversity of the autochthonous community is low, increasing the chance of ARGs to transfer to community members. Reciprocally, high microbial diversity could serve as a natural long-term barrier towards invasion by ARB and ARGs. Results To test this hypothesis, a sampling campaign across seven European countries was carried out to obtain 172 environmental samples from sites with low anthropogenic impact. Samples were collected from contrasting environments: stationary structured forest soils, or dynamic river biofilms and sediments. Microbial diversity and relative abundance of 27 ARGs and 5 mobile genetic element marker genes were determined. In soils, higher diversity, evenness and richness were all significantly negatively correlated with the relative abundance of the majority (>85%) of ARGs. Furthermore, the number of detected ARGs per sample was inversely correlated with diversity. However, no such effects were found for the more dynamic, regularly mixed rivers. Conclusions: In conclusion, we demonstrate that diversity can serve as barrier towards AMR dissemination in the environment. This effect is mainly observed in stationary, structured environments, where long-term, diversity-based resilience against invasion can evolve. Such barrier effects can in the future be exploited to limit the environmental proliferation of AMR.

Abstract Isolation Forests is an unsupervised machine learning technique for detecting outliers in continuous datasets that does not require an underlying equivariant or Gaussian distribution and is suitable for use on small datasets. While this procedure is widely used across quantitative fields, to our knowledge, this is the first attempt to solely assess its use for microbiome datasets. Here we present uniForest, an interactive Python notebook (which can be run from any desktop computer using the Google Colaboratory web service) for the processing of microbiome outliers. We used uniForest to apply Isolation Forests to the Healthy Human Microbiome project dataset and imputed outliers with the mean of the remaining inliers to maintain sample size and assessed its prowess in variance reduction in both community structure and derived ecological statistics (α-diversity). We also assessed its functionality in anatomical site differentiation (pre- and postprocessing) using principal component analysis, dissimilarity matrices, and ANOSIM. We observed a minimum variance reduction of 81.17% across the entire dataset and in alpha diversity at the Phylum level. Application of Isolation Forests also separated the dataset to an extremely high specificity, reducing variance within taxa samples by a minimum of 81.33%. It is evident that Isolation Forests are a potent tool in restricting the effect of variance in microbiome analysis and has potential for broad application in studies where high levels of microbiome variance is expected. This software allows for clean analyses of otherwise noisy datasets.

Abstract When antimicrobial resistant bacteria (ARB) and genes (ARGs) reach novel habitats, they can become part of the habitat’s microbiome in the long term if they are able to overcome the habitat’s biotic resilience towards immigration. This process should become more difficult with increasing biodiversity, as exploitable niches in a given habitat are reduced for immigrants when more diverse competitors are present. Consequently, microbial diversity could provide a natural barrier towards antimicrobial resistance by reducing the persistence time of immigrating ARB and ARG. To test this hypothesis, a pan-European sampling campaign was performed for structured forest soil and dynamic riverbed environments of low anthropogenic impact. In soils, higher diversity, evenness and richness were significantly negatively correlated with relative abundance of >85% of ARGs. Furthermore, the number of detected ARGs per sample were inversely correlated with diversity. However, no such effects were present in the more dynamic riverbeds. Hence, microbiome diversity can serve as a barrier towards antimicrobial resistance dissemination in stationary, structured environments, where long-term, diversity-based resilience against immigration can evolve.

Abstract There is a reproducibility crisis in scientific studies. Some of these crises arise from incorrect application of statistical tests to data that follow inappropriate distributions, have inconsistent equivariance, or have very small sample sizes. As determining which test is most appropriate for all data in a multicategorical study (such as comparing taxa between sites in microbiome studies), we present statsSuma, an interactive Python notebook (which can be run from any desktop computer using the Google Colaboratory web service) and does not require a user to have any programming experience. This software assesses underlying data structures in a given dataset to advise what pairwise or listwise statistical procedure would be best suited for all data. As some users may be interested in further mining specific trends, statSuma performs 5 different two-tailed pairwise tests (Student’s t -test, Welch’s t -test, Mann-Whitney U -test, Brunner-Munzel test, and a pairwise Kruskal-Wallis H -test) and advises the best test for each comparison. This software also advises whether ANOVA or a multicategorical Kruskal-Wallis H- test is most appropriate for a given dataset and performs both procedures. A data distribution- vs -Gaussian distribution plot is produced for each taxon at each site and a variance plot between all combinations of 2 taxa at each site are produced so Gaussian tests and variance tests can be visually confirmed alongside associated statistical determinants.

Abstract Enterococcus faecium has emerged as an important nosocomial pathogen, which is increasingly difficult to treat due to the genetic acquisition of vancomycin resistance. Ireland exhibits a recalcitrant vancomycin resistant bloodstream infection rate compared to other developed countries. A set of 28 vancomycin resistant isolates was sequenced to construct a dataset alongside 61 other publicly available Irish genomes. This dataset was extensively analysed using in-silico methodologies and uncovered distinct evolutionary, coevolutionary, and clinically relevant population trends. These results suggest that a stable (in terms of genome size, GC%, and number of genes), yet genetically diverse population (in terms of gene content) of Enterococcus faecium persist in Ireland with acquired resistance arising via plasmid acquisition ( vanA ) or to a lesser extent, chromosomal recombination ( vanB ). Population analysis described five clusters with one cluster partitioned into four clades which transcend isolation dates. Pangenomic and recombination analyses revealed an open (whole genome and chromosomal specific) pangenome illustrating a rampant evolutionary pattern. Comparative resistomics and virulomics uncovered distinct chromosomal and mobilomal propensity for multidrug resistance, widespread chromosomal point-mutation mediated resistance, and chromosomal harboured arsenals of virulence factors. Comparative phagomics revealed a core prophagome of three prophages throughout the dataset. Interestingly, a potential difference in biofilm formation strategies was highlighted by coevolutionary analysis, suggesting differential biofilm genotypes between vanA and vanB isolates. These results highlight the evolutionary history of Irish Enterococcus faecium isolates and may provide an insight into underlying infection dynamics in a clinical setting.

Executive summary Food supplements are defined in European Union (EU) food law (Directive 2002/46/EC, S.I. No. 506 of 2007) as “foodstuffs the purpose of which is to supplement the normal diet and which are concentrated sources of nutrients or other substances with a nutritional or physiological effect, alone or in combination, marketed in dose form, namely forms such as capsules, pastilles, tablets, pills and other similar forms, sachets of powder, ampoules of liquids, drop dispensing bottles, and other similar forms of liquids and powders designed to be taken in measured small unit quantities”. Directive 2002/46/EC provides for the setting of maximum safe levels of vitamins and minerals in food supplements. Other substances, including live microbes (“probiotics”) and their products, can be included in food supplements provided they are safe (Regulation (EC) No 178/2002, S.I. No. 747 of 2007). In the absence of EU guidance, the Food Safety Authority of Ireland (FSAI) through this document will provide guidance to food supplement producers and food business operators (FBOs) on assessing the safety of “probiotics” used in food supplements in Ireland. To facilitate efficient monitoring of food supplements, Directive 2002/46/EC allows EU Member States (MS) to require the food supplement producer, or the person placing a food supplement product on the market, to notify the competent authority for that country. Ireland requires this notification. In Ireland, notification is not an approval or authorisation procedure. A notification is made by completing an online notification form, which includes submitting a copy of the product label to the FSAI. The most widely used “probiotics” in food supplements are strains of lactic acid bacteria (LAB), bifidobacteria, Bacillus sporogenes and the yeast Saccharomyces boulardii. The potential risks from consuming “probiotics” in food include infection, ill effects from microbial toxins produced by the microbial strains or contaminants, transmission of antimicrobial resistance and immunological effects. Reported adverse events resulting from consuming “probiotics” are few. Where opportunistic infections associated with “probiotics” in foods or food supplements are reported, they are usually in people at increased risk of infection where various underlying factors such as damage to the skin or mucous membranes, indwelling medical devices, alterations to the gut microbiome or impaired immune response may enable infection by organisms that are rarely or never associated with infection in otherwise healthy people. The European Food Safety Authority (EFSA) introduced the concept of Qualified Presumption of Safety (QPS) to standardise its own safety evaluation of microorganisms used in “regulated products” (i.e. feed additive, food additive, food flavourings, food enzymes, novel foods and plant protection products). The QPS assessment is conducted separately from and independently of the safety assessment of a regulated product submitted for market authorisation. Therefore, having QPS status does not guarantee market authorisation. The first list of biological agents with QPS status was established in 2007. The QPS list is described at the species level for bacteria and yeasts, and at family level for viruses. EFSA performs an extensive literature search and then updates the QPS list every 6 months. In addition, the EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ panel) publishes a Scientific Opinion on the updated QPS list every 3 years. The FSAI uses the QPS list as a point of reference when assessing the safety of microbes or their by‐products in foods. In 2018, the EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP Panel) published “Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms”. There is currently no EU guidance on the criteria to be used for the safety assessment of “probiotics” in food supplements, or the evidence a food supplement producer should use to assess the safety of “probiotics” in food supplements. This Scientific Committee report addresses two questions and makes the following recommendations: Question 1. What is the committee's view on the most appropriate safety criteria to use when assessing the safety of “probiotics” in food supplements? The Committee considers the most appropriate safety criteria to be that: There is long experience of use of the organism(s) in food or food supplements without substantiated report of harm in otherwise healthy people. Credible reports of infection or intoxication associated with the organism are isolated or rare and limited to those people at highest risk of infection. The organism(s) is readily identifiable to at least species level. There is an antimicrobial agent available for treatment of infection with the organism(s). The organism(s) has no known association with environmental harm. If the organism(s) was not used in food in the EU prior to 15 May 1997, its use has been authorised under the novel food Regulation (EU) 2015/2283. If the organism(s) was genetically modified, it has been authorised under Regulation (EC) No 1829/2003 on genetically modified food and feed, and under Directive 2001/18/EC on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms. The organism(s) has been rigorously characterised as follows: The definition of species and strain level is adequate to facilitate comparison in the event of suspected link to human infection. There is evidence of the absence of properties associated with an increased potential to cause infection. There is evidence of the absence of acquired (transferable) antimicrobial resistance genes. There is evidence of the absence of a capacity for biogenic amine production. Question 2. What evidence should a food supplement producer use to demonstrate the safety of “probiotics” when producing a food supplement? The Committee considers that a food supplement producer should be able to demonstrate that: The organism(s) used meets the criteria set out above. The culture has been deposited in a recognised and accessible culture collection if not obtained from a culture collection. If cultures are stored, they are stored at ‐80 °C to ensure that they remain stable in storage. If cultures are propagated, the characterisation of the organism should be repeated at defined intervals to ensure that the organism has not significantly altered or been inadvertently displaced by, or contaminated with, another organism. The production process does not result in substantial change to the properties of the microorganism(s) between start of production and the end product. The production systems have adequate quality management systems to ensure consistent properties of the organism(s) in the final product. In addition, the Scientific Committee made the following recommendations: Food supplement producers should document the food safety management system adopted to ensure consistent safe manufacture of the food supplement. The individual microbial strains used should be stored and accessible (either from the food supplement producer or from a culture collection) in the event of a suspected link to human infection. In line with the requirements of the Regulation on the provision of food information to consumers (Regulation (EU) No. 1169/2011), accurate information should be provided to the consumer on the label. It is recommended that this information includes the type and number of organisms present as well as appropriate storage advice. In addition, the viability of the organism(s) throughout the shelf life of the product should be determined to ensure that the information on the product label is accurate throughout the shelf life. Furthermore, where it is known that there are groups of people for whom the strain or strains used may not be suitable, this should be indicated on the label. If an Enterococcus faecium strain is included as a “probiotic” in a food supplement, the label should clearly indicate the presence of Enterococcus faecium in the food supplement.

Metabolomics and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy have proven to be useful for characterising key metabolome fluctuations in bacteria during stress responses to various environmental agents and antibiotics. However, a number of impediments to current workflows have led to the reduced use of these techniques in microbial research. In this study, we address these limitations and in response have developed a novel 1H NMR-based untargeted metabolomics workflow. This method is suitable for use with various bacterial species, reducing the workload in comparison to previously established workflows. Our protocol is simple and reproducible and allows for the isolation of both intracellular (IC) and extracellular (EC) metabolites simultaneously from both Gram (+) and Gram (-) species. This method has been shown to produce consistent results for the ESKAPE pathogens Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. By using these data as a baseline, future studies involving a myriad of stress conditions can be compared to identify key metabolome differences in each species and to determine the mechanisms utilised by bacteria to respond to stress.