Leishmania species cause a spectrum of human diseases in tropical and subtropical regions of the world. We have sequenced the 36 chromosomes of the 32.8-megabase haploid genome of Leishmania major (Friedlin strain) and predict 911 RNA genes, 39 pseudogenes, and 8272 protein-coding genes, of which 36% can be ascribed a putative function. These include genes involved in host-pathogen interactions, such as proteolytic enzymes, and extensive machinery for synthesis of complex surface glycoconjugates. The organization of protein-coding genes into long, strand-specific, polycistronic clusters and lack of general transcription factors in the L. major, Trypanosoma brucei , and Trypanosoma cruzi (Tritryp) genomes suggest that the mechanisms regulating RNA polymerase II–directed transcription are distinct from those operating in other eukaryotes, although the trypanosomatids appear capable of chromatin remodeling. Abundant RNA-binding proteins are encoded in the Tritryp genomes, consistent with active posttranscriptional regulation of gene expression.

Abstract Nucleosomes composed of histones are the fundamental units around which DNA is wrapped to form chromatin. Transcriptionally active euchromatin or repressive heterochromatin is regulated in part by the addition or removal of histone post-translational modifications (PTMs) by ‘writer’ and ‘eraser’ enzymes, respectively. Nucleosomal PTMs are recognised by a variety of ‘reader’ proteins which alter gene expression accordingly. The histone tails of the evolutionarily divergent eukaryotic parasite Trypanosoma brucei have atypical sequences and PTMs distinct from those often considered universally conserved. Here we identify 68 predicted readers, writers and erasers of histone acetylation and methylation encoded in the T. brucei genome and, by epitope tagging, systemically localize 63 of them in the parasite’s bloodstream form. ChIP-seq demonstrated that fifteen candidate proteins associate with regions of RNAPII transcription initiation. Eight other proteins exhibit a distinct distribution with specific peaks at a subset of RNAPII transcription termination regions marked by RNAPIII-transcribed tRNA and snRNA genes. Proteomic analyses identified distinct protein interaction networks comprising known chromatin regulators and novel trypanosome-specific components. Notably, several SET-domain and Bromo-domain protein networks suggest parallels to RNAPII promoter-associated complexes in conventional eukaryotes. Further, we identify likely components of TbSWR1 and TbNuA4 complexes whose enrichment coincides with the SWR1-C exchange substrate H2A.Z at RNAPII transcriptional start regions. The systematic approach employed provides detail of the composition and organization of the chromatin regulatory machinery in Trypanosoma brucei and establishes a route to explore divergence from eukaryotic norms in an evolutionarily ancient but experimentally accessible eukaryote.

Abstract To compare biological processes between conditions, alignment of single cell transcriptomic trajectories can be performed. Current tools place constraints on what data can be aligned. We present Trajectory Alignment of Gene Expression Dynamics (TrAGEDy) which overcomes these constraints, allowing the alignment of asymmetric biological processes. Across simulated and real datasets, TrAGEDy returns correct alignment based on underlying simulated process, where current tools fail. Across different biological contexts, TrAGEDy can capture biologically relevant genes which other differential expression methods fail to detect. TrAGEDy provides a new tool for in-depth analysis of many emerging single cell transcriptomic datasets.

Abstract The life cycles of African trypanosomes are dependent on several differentiation steps, where parasites transition between replicative and non-replicative forms specialised for infectivity and survival in mammal and tsetse fly hosts. Here, we use single cell transcriptomics (scRNA-seq) to dissect the asynchronous differentiation of replicative slender to transmissible stumpy bloodstream form Trypanosoma brucei . Using oligopeptide-induced differentiation, we accurately modelled stumpy development in vitro and captured the transcriptomes of 9,344 slender and stumpy stage parasites, as well as parasites transitioning between these extremes. Using this framework, we detail the relative order of biological events during development, profile dynamic gene expression patterns and identify putative novel regulators. Using marker genes to deduce the cell cycle phase of each parasite, we additionally map the cell cycle of proliferating parasites and position stumpy cell cycle exit at early G1, with subsequent progression to a distinct G0 state. We also explored the role of one gene, ZC3H20, with transient elevated expression at the key slender to stumpy transition point. By scRNA-seq analysis of ZC3H20 null parasites exposed to oligopeptides and mapping the resulting transcriptome to our atlas of differentiation, we identified the point of action for this key regulator. Using a developmental transition relevant for both virulence in the mammalian host and disease transmission, our data provide a paradigm for the temporal mapping of differentiation events and regulators in the trypanosome life cycle.

2. Abstract Trypanosoma brucei evansi and Trypanosoma brucei equiperdum are animal infective trypanosomes conventionally classified by their clinical disease presentation, mode of transmission, host range, kDNA composition and geographic distribution. Unlike other members of the subgenus Trypanozoon , they are non-tsetse transmitted and predominantly morphologically uniform (monomorphic) in their mammalian host. Their classification as independent species or subspecies has been long debated and genomic studies have found that isolates within T. b. evansi and T. b. equiperdum have polyphyletic origins. Since current taxonomy does not fully acknowledge these polyphyletic relationships, we re-analysed publicly available genomic data to carefully define each clade of monomorphic trypanosome. This allowed us to identify, and account for, lineage specific variation. We included a recently published isolate, IVM-t1, which was originally isolated from the genital mucosa of a horse with dourine and typed as T. equiperdum . Our analyses corroborate previous studies in identifying at least four distinct monomorphic T. brucei clades. We also found clear lineage specific variation in the selection efficacy and heterozygosity of the monomorphic lineages, supporting their distinct evolutionary histories. The inferred evolutionary position of IVM-t1 suggests its reassignment to the T. b. evansi type B clade, challenging the relationship between the Trypanozoon species, the infected host, mode of transmission and the associated pathological phenotype. The analysis of IVM-t1 also provides the first evidence of the expansion of T. b. evansi type B, or a 5 th monomorphic lineage represented by IVM-t1, outside of Africa, with important possible implications for disease diagnosis. 3. Impact statement Trypanosoma brucei are unicellular parasites typically transmitted by tsetse flies. Subspecies of T. brucei cause human African trypanosomiasis and the animal diseases, nagana, surra and dourine. T. b. evansi and T. b. equiperdum have branched from T. brucei and, by foregoing tsetse transmission, expanded their geographic range beyond the sub-Saharan tsetse belt. These species can only reproduce asexually and exhibit morphological uniformity in their host (‘monomorphism’). T. b. evansi and T. b. equiperdum have historically been classified based on fragmentary information on the parasites’ transmission routes, geographic distribution, kDNA composition and disease phenotypes. Our analysis of genome sequencing data from monomorphic T. brucei supports at least four independent origins with distinct evolutionary histories. One isolate, IVM-t1, typed as T. equiperdum , is a closer relative to T. b. evansi , highlighting the risk of using pathognomonic descriptors for subspecies assignment. We show clear lineage specific variation in the selection efficacy in monomorphic T. brucei . Using the evolutionary relationships between lineages, we suggest it would be beneficial to reconcile phylogeny and pathology in monomorphic trypanosomes. 4. Data summary The data used in this study is available from the Sequence Read Archive or the Wellcome Sanger Institute. The accessions can be found in Supplementary file 1.

Abstract African trypanosomes proliferate as bloodstream forms and procyclic forms in the mammal and tsetse fly midgut, respectively. This allows them to colonise the host environment upon infection and ensure life cycle progression. Yet, understanding of the mechanisms that regulate and drive the cell replication cycle of these forms is limited. Using single cell transcriptomics on unsynchronised cell populations, we have obtained high resolution cell cycle regulated transcriptomes of both procyclic and slender bloodstream form Trypanosoma brucei without prior cell sorting or synchronisation. Additionally, we describe an efficient freeze-thawing protocol that allows single cell transcriptomic analysis of cryopreserved T. brucei . Computational reconstruction of the cell cycle using periodic pseudotime inference allowed the dynamic expression patterns of cycling genes to be profiled for both life cycle forms. Comparative analyses identify a core cycling transcriptome highly conserved between forms, as well as several genes where transcript levels dynamics are form-specific. Comparing transcript expression patterns with protein abundance revealed that the majority of genes with periodic cycling transcript and protein levels exhibit a relative delay between peak transcript and protein expression. This work reveals novel detail of the cell cycle regulated transcriptomes of both forms, which are available for further interrogation via an interactive webtool.

Summary Trypanosomes causing African sleeping sickness use quorum-sensing (QS) to generate transmission-competent stumpy forms in their mammalian hosts. This density-dependent process is signalled by oligopeptides that stimulate the signal transduction pathway leading to stumpy formation. Using mass spectrometry analysis, peptidases released by trypanosomes were identified and, for 12 peptidases, their extracellular delivery was confirmed. Thereafter, the contribution of each peptidase to QS signal production was determined using systematic inducible overexpression in vivo , activity being confirmed to operate through the physiological QS signalling pathway. Gene knockout of the QS-active peptidases identified two enzymes, oligopeptidase B and metallocarboxypeptidase I, that significantly reduced QS when ablated individually. Further, a combinatorial gene knockout of both peptidases confirmed their dominance in the generation of the QS signal, with peptidase release of oligopeptidase B mediated via an unconventional protein secretion pathway. This identifies how the QS signal driving trypanosome virulence and transmission is generated in mammalian hosts. Abstract Figure Graphical Abstract

ABSTRACT Kinetoplastids are a highly divergent lineage of eukaryotes with unusual mechanisms for regulating gene expression. We previously surveyed 65 putative chromatin factors in the kinetoplastid Trypanosoma brucei . Our analyses revealed that the predicted histone methyltransferase SET27 and the Chromodomain protein CRD1 are tightly concentrated at RNAPII transcription start regions (TSRs). Here we report that SET27 and CRD1, together with four previously uncharacterized constituents, form the SET27 promoter-associated regulatory complex (SPARC), which is specifically enriched at TSRs. SET27 loss leads to aberrant RNAPII recruitment to promoter sites, accumulation of polyadenylated transcripts upstream of normal transcription start sites, and conversion of some normally unidirectional promoters to bidirectional promoters. Transcriptome analysis in the absence of SET27 revealed upregulated mRNA expression in the vicinity of SPARC peaks within the main body of chromosomes in addition to derepression of genes encoding variant surface glycoproteins (VSGs) located in subtelomeric regions. These analyses uncover a novel chromatin-associated complex required to establish accurate promoter position and directionality.

Abstract African trypanosomes are important parasites in sub-Saharan Africa that undergo a quorum-sensing dependent development to morphologically ‘stumpy forms’ in mammalian hosts to favour transmission by tsetse flies. However, some trypanosome clades have simplified their lifecycle by escaping dependence on tsetse allowing an expanded geographic range, with direct transmission between hosts achieved via blood-feeding biting flies and vampire bats ( Trypanosoma brucei evansi , causing ‘surra’) or through sexual transmission ( Trypanosoma brucei equiperdum , causing ‘dourine’). Concomitantly, stumpy formation is reduced and the isolates are described as monomorphic, with infections spread widely in Africa, Asia, South America and parts of Europe. Here, using genomic analysis of distinct field isolates, we identify molecular changes that accompany the loss of the stumpy formation in monomorphic clades. Using CRISPR-mediated allelic replacement, mutations in two exemplar genes (Tb927.2.4020; Tb927.5.2580) are confirmed to reduce stumpy formation whereas another (Tb927.11.3400) is implicated in altered motility. Using laboratory selection we identify downregulation of RNA regulators as important in the initial development of monomorphism. This identifies a trajectory of events that simplify the life cycle in emergent and established monomorphic trypanosomes, with impact on disease spread, vector control strategies, geographical range and virulence.