Abstract Stimulator of interferon genes (STING) is a central component of the cytosolic nucleic acids sensing pathway and as such master regulator of the type I interferon response. Due to its critical role in physiology and its’ involvement in a variety of diseases, STING has been a focus for drug discovery. Targeted protein degradation (TPD) has emerged as a promising pharmacology for targeting previously considered undruggable proteins by hijacking the cellular ubiquitin proteasome system (UPS) with small molecules. Here, we identify AK59 as a STING degrader leveraging HERC4, a HECT-domain E3 ligase. Additionally, our data reveals that AK59 is effective on the common pathological STING mutations, suggesting a potential clinical application of this mechanism. Thus, these findings introduce HERC4 to the fields of TPD and of compound-induced degradation of STING, suggesting potential therapeutic applications.

ABSTRACT Targeted protein degradation (TPD) of neo-substrates with proteolysis targeting chimeras (PROTACs) or molecular glues has emerged as a key modality in exploring new biology as well as designing new drug candidates where catalytic inhibition is neither efficacious nor an option. TPD is mediated through harnessing E3 ligases and redirecting them to ubiquitinate de novo target proteins for subsequent proteasomal degradation. Until recently, E3 ligase chemical matter available for mediating TPD has been limited to a relatively low number of ligases, considering that over 600 E3 ligases are encoded by the human genome. In addition, the most utilized ligase for TPD approaches, CRBN, has been observed to be downregulated in settings of acquired resistance to immunomodulatory inhibitory drugs (IMiDs). IMiDs are molecular glues that target IKZF transcription factors to CRBN for degradation. Resistance is potentially accelerated by non-essentiality of CRBN for cell viability. Here we investigated if the essential E3 ligase receptor DCAF1 can be harnessed for TPD utilizing a potent, non-covalent DCAF1 binder. We show that this binder, selective for the CRL4 DCAF1 E3 ligase complex, can be functionalized into an efficient DCAF1-BRD9 PROTAC. Chemical and genetic rescue experiments confirm specific degradation via the CRL4 DCAF1 E3 ligase. We further highlight the versatility of DCAF1 for TPD by developing a DCAF1-dasatininb PROTAC targeting multiple cytosolic and membrane bound tyrosine kinases. We expand these findings towards Bruton’s tyrosine kinase (BTK) selective PROTACs and through extensive optimization and characterization efforts share key observations that led to a potent and selective DCAF1-BTK PROTAC (DBt-10). Finally, with this PROTAC DBt-10, we show rescue of BTK degradation in a BTK-dependent, CRBN-degradation-resistant cell line and provide a rationale for E3 ligase swap to overcome CRBN mediated resistance.

Members of the ATP-dependent SWI/SNF chromatin remodeling complexes are among the most frequently mutated genes in cancer, suggesting their dysregulation plays a critical role. The synthetic lethality between SWI/SNF catalytic subunits BRM/SMARCA2 and BRG1/SMARCA4 has instigated great interest in targeting BRM. Here we have performed a critical and in-depth investigation of novel dual inhibitors (BRM011 and BRM014) of BRM and BRG1 in order to validate their utility as chemical probes of SWI/SNF catalytic function, while obtaining insights into the therapeutic potential of SWI/SNF inhibition. In corroboration of on-target activity, we discovered compound resistant mutations through pooled screening of BRM variants in BRG1-mut cancer cells. Strikingly, genome-wide transcriptional and chromatin profiling (ATAC-Seq) provided further evidence of pharmacological perturbation of SWI/SNF chromatin remodeling as BRM011 treatment induced specific changes in chromatin accessibility and gene expression similar to genetic depletion of BRM. Finally, these compounds have the capacity to inhibit the growth of tumor-xenografts, yielding important insights into the feasibility of developing BRM/BRG1 ATPase inhibitors for the treatment of BRG1-mut lung cancers. Overall, our studies not only establish the feasibility of inhibiting SWI/SNF catalytic function, providing a framework for SWI/SNF therapeutic targeting, but have also yielded successful elucidation of small-molecule inhibitors that will be of importance in probing SWI/SNF function in various disease contexts.

Abstract Stimulator of interferon genes (STING) is a central component of the pathway sensing the presence of cytosolic nucleic acids, having a key role in type I interferon innate immune response. Localized at the endoplasmic reticulum (ER), STING becomes activated by cGAMP, which is generated by the intracellular DNA sensor cyclic GMP-AMP synthase (cGAS). Due to its critical role in physiological function and its ‘ involvement in a variety of diseases, STING has been a notable focus for drug discovery. Recent advances in drug discovery allow the targeting of proteins previously considered “un-druggable” by novel mechanism of actions. Molecular glue degraders are defined as the compounds leading targeted protein degradation (TPD) by creating novel ligase-substrate interactions. Here, we identified AK59 as a novel molecular glue degrader for STING. A genome-wide, CRISPR/Cas9 knockout screen showed that the compound-mediated degradation of STING by AK59 is compromised by the loss of HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 4 (HERC4), ubiquitin-like modifier activating enzyme 5 (UBA5) and ubiquitin like modifier activating enzyme 6 (UBA6). While UBA5 and UBA6 could be the auxiliary factors for AK59 activity, our results indicate that HERC4 is the main E3 ligase for the observed degradation mechanism. Validation by individual CRISPR knockouts, co-immunoprecipitations, as well as proximity mediated reporter assays suggested that AK59 functions as a glue degrader by forming a novel interaction between STING and HERC4. Furthermore, our data reveals that AK59 was effective on the most common pathological STING mutations that cause STING-associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI), suggesting a potential clinical application of this mechanism. Thus, these findings not only reveal a novel mechanism for compound-induced degradation of STING but also utilize HERC4 as potential E3 ligase that for TPD, enabling novel therapeutic applications.