Upon heterologous overexpression, many proteins misfold or aggregate, thus resulting in low functional yields. Human acetylcholinesterase (hAChE), an enzyme mediating synaptic transmission, is a typical case of a human protein that necessitates mammalian systems to obtain functional expression. We developed a computational strategy and designed an AChE variant bearing 51 mutations that improved core packing, surface polarity, and backbone rigidity. This variant expressed at ∼2,000-fold higher levels in E. coli compared to wild-type hAChE and exhibited 20°C higher thermostability with no change in enzymatic properties or in the active-site configuration as determined by crystallography. To demonstrate broad utility, we similarly designed four other human and bacterial proteins. Testing at most three designs per protein, we obtained enhanced stability and/or higher yields of soluble and active protein in E. coli. Our algorithm requires only a 3D structure and several dozen sequences of naturally occurring homologs, and is available at http://pross.weizmann.ac.il.

Abstract Nucleobase-containing coenzymes are considered the relics of an early RNA-based world that preceded the emergence of protein domains. Despite the importance of coenzyme-protein synergisms, their emergence and evolution remain poorly understood. An excellent target to address this issue is the Rossman fold, the most catalytically diverse and abundant protein architecture in Nature. Here, we investigatedted the two largest Rossman lineages, namely the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P))-binding and the S-adenosyl methionine (SAM)-dependent superfamilies. With the aim to identify the evolutionary changes that lead to a switch in coenzyme specificity on these superfamilies, we performed structural and sequence-based Hidden Markov Models to systematically search for key motifs in their coenzyme-binding pockets. Our analyses revealed how insertions and deletions (InDels) reshaped the ancient β1−loop−α1 coenzyme-binding structure of NAD(P) into the well-defined SAM-binding β1−loop−α1 structure. To prove this observation experimentally, we removed an InDel of three amino acids from the NAD(P) coenzyme pocket and solved the structure of the resulting mutant, revealing the characteristic features of the SAM-binding pocket. To confirm the binding to SAM, we performed isothermal titration calorimetry measurements, validating the successful coenzyme switch. Molecular dynamics simulations also corroborated the role of InDels in abolishing NAD-binding and acquiring SAM binding. Our results uncovered how Nature utilized insertions and deletions to switch coenzyme specificity, and in turn, functionalities between these superfamilies. This work also establishes how protein structures could have been recycled through the course of evolution to adopt different coenzymes and confer different chemistries. Significance Statement Cofactors are ubiquitous molecules necessary to drive about half of the enzymatic reactions in Nature. Among them, organic cofactors (coenzymes) that contain nucleotide moieties are believed to be relics of a hypothetical RNA world. Understanding coenzyme-binding transitions sheds light onto the emergence of the first enzymes and their chemical diversity. Rossmann enzymes bind to 7 out of 10 nucleotide coenzymes, representing an ideal target to study how different coenzyme specificities emerged and evolved. Here we demonstrated how insertions and deletions reshape coenzyme-specificity in Rossmann enzymes by retracing the emergence of the SAM-binding function from an NAD-binding ancestor. This work constitutes the first example of an evolutionary bridge between redox and methylation reactions, providing a new strategy to engineer coenzyme specificity.

Abstract SAR11 bacteria are the most abundant members of the global ocean microbiome and have a broad impact on ocean ecosystems. To thrive in their competitive oligotrophic environments, these bacteria rely on solute-binding proteins (SBPs) that facilitate nutrient uptake through ABC transporters. Nonetheless, previous studies have been unable to access the molecular mechanisms and functions of these transporters because they rely heavily on homology-based predictions. These mechanisms and functions are essential to understand biogeochemical cycling in the ocean, including assimilation of dissolved organic matter (DOM). Here, by doing a biochemical study of the collective behavior of all SBPs in a SAR11 bacterium, we discover that these transporters have unprecedented binding affinity ( K d ≥30 pM) and unexpectedly high binding specificity, revealing molecular mechanisms for oligotrophic adaptation. Our study uncovers new carbon sources for the SAR11 bacteria and provides an accurate biogeographical map of nutrient uptake in the ocean. Our results show how functional adaptation at the molecular level in ubiquitous marine bacteria impacts global patterns of DOM assimilation and provides insight into the contribution of different compounds to oceanic nutrient cycles.

Abstract Methionine adenosyltransferase (MAT), which catalyzes the biosynthesis of S-adenosylmethionine from L-methionine and ATP, is an ancient, highly conserved enzyme present in all three domains of life. Although the MAT enzymes of each domain are believed to share a common ancestor, the sequences of archaeal MATs show a high degree of divergence from the sequences of bacterial and eukaryotic MATs. However, the structural and functional consequences of this sequence divergence are not well understood. Here, we use structural bioinformatics analysis and ancestral sequence reconstruction to highlight the consequences of archaeal MAT divergence. We show that the dimer interface containing the active site, which would be expected to be well conserved across all three domains, diverged considerably between the bacterial/eukaryotic MATs and archaeal MATs. Furthermore, the characterization of reconstructed ancestral archaeal MATs showed that they probably had low substrate specificity which expanded during their evolutionary trajectory hinting towards the observation that all the modern day MAT enzymes from the three-kingdom probably originated from a common specific ancestor and then archaea MATs diverged in sequence, structure and substrate specificity. Altogether, our results show that the archaea MAT is an ideal system for studying an enzyme family which evolved to display high degrees of divergence at the sequence/structural levels and yet are capable of performing the same catalytic reactions as their orthologous counterparts.

Epidermal Growth Factor Receptor is a tyrosine kinase receptor that plays a key role in cells. Its ligands contribute to the system modularity by influencing the stability of the dimerized receptor. A synthetically modified ligand could be a potential anti-cancer drug if able to compete with the endogenous ligands while modulating a different pathway activation. Herein, we developed a cross-conservation approach to identify functionally important EGF residues. Four EGF mutants have been selected and studied. These mutants show binding affinities for EGFR similar to EGF, while the effect at the cellular level changed, increasing growth rate in fibroblasts and reducing apoptosis in skin cancer cells. These results support the theory of biased signaling in the tyrosine kinase receptor system.* EGF : Epidermal Growth Factor EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor PPI : Protein-Protein Interaction MSA : Multiple Sequence Alignment MSTA : Multiple STructural Alignment ITC : Isothermal Titration Calorimetry DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium ECD : Extra Cellular Domain WT : Wild Type

Abstract Oxalate decarboxylase (OxDC) from Bacillus subtilis is a Mn-dependent hexameric enzyme which converts oxalate to carbon dioxide and formate. Recently, OxDC has attracted the interest of the scientific community, due to its biotechnological and medical applications for the treatment of hyperoxalurias, a group of pathologic conditions associated with excessive oxalate urinary excretion due to either increased endogenous production or increased exogenous absorption. The fact that OxDC displays optimum pH in the acidic range, represents a big limitation for most biotechnological applications involving processes occurring at neutral pH, where the activity and stability of the enzyme are remarkably reduced. Here, through bioinformatics-guided protein engineering, followed by combinatorial mutagenesis and analyses of activity and thermodynamic stability, we identified a double mutant of OxDC endowed with enhanced catalytic efficiency and stability under physiological conditions. The obtained engineered form of OxDC offers a potential tool for improved intestinal oxalate degradation in hyperoxaluria patients.

Abstract In nature, chemotactic interactions are ubiquitous and play a critical role in driving the collective behaviour of living organisms. Reproducing these interactions in vitro is still a paramount challenge due to the complexity of mimicking and controlling cellular features, such as metabolic density, cytosolic macromolecular crowding and cellular migration, on a microorganism size scale. Here we generate enzymatically-active cell-size droplets able to move freely and, by following a chemical gradient, able to interact with the surrounding droplets in a collective manner. The enzyme within the droplets generates a pH gradient that extends outside the edge of the droplets. We discovered that the external pH gradient triggers droplet migration and controls its directionality, which is selectively towards the neighbouring droplets. Hence, by changing the enzyme activity inside the droplet we tuned the droplet migration speed. Further, we showed that these cellular-like features can facilitate the reconstitution of a simple and linear protometabolic pathway with improved overall activity. Our work suggests that simple and stable membraneless droplets can be applied to reproduce complex biological phenomena opening new perspectives as bioinspired materials and synthetic biology tools.

Abstract Loops are small secondary structural elements that play a crucial role in the emergence of new enzyme functions. However, our understanding of loop functions is mainly limited to the catalytic loops. To understand the function of remote loops in enzymes, we studied Glycoside hydrolase family 19 (GH19) chitinase - an essential enzyme family for pathogen degradation in plants. By revealing the evolutionary history and loops appearance of GH19 chitinase, we discovered that one loop which is remote from the catalytic site, is necessary to acquire the new antifungal activity. We demonstrated that this remote loop directly accesses the fungal cell wall, and surprisingly, it needs to adopt a defined structure supported by long-range intramolecular interactions to perform its function. Our findings prove that Nature applies this new strategy at the molecular level to achieve a complex biological function while maintaining the original activity one in the catalytic pocket, suggesting an alternative way to design new enzyme function.

Abstract Protein conformational change can facilitate the binding of non-cognate substrates and underlie promiscuous activities. However, the contribution of substrate conformational dynamics to this process is comparatively poorly understood. Here we analyse human (hMAT2A) and Escherichia coli (eMAT) methionine adenosyltransferases that have identical active sites but different substrate specificity. In the promiscuous hMAT2A, non-cognate substrates bind in a stable conformation to allow catalysis. In contrast, non-cognate substrates rarely sample stable productive binding modes in eMAT owing to altered mobility in the enzyme active site. Different cellular concentrations of substrate likely drove the evolutionary divergence of substrate specificity in these orthologs. The observation of catalytic promiscuity in hMAT2A led to the detection of a new human metabolite, methyl thioguanosine, that is produced at elevated level in a cancer cell line. This work establishes that identical active sites can result in different substrate specificity owing to the effects of substrate and enzyme dynamics.

Living cells harvest energy from their environments to drive the chemical processes that enable life. We introduce a minimal system that operates at similar protein concentrations, metabolic densities, and length scales as living cells. This approach takes advantage of the tendency of phase-separated protein droplets to strongly partition enzymes, while presenting minimal barriers to transport of small molecules across their interface. By dispersing these microreactors in a reservoir of substrate-loaded buffer, we achieve steady states at metabolic densities that match those of the hungriest microorganisms. We further demonstrate the formation of steady pH gradients, capable of driving microscopic flows. Our approach enables the investigation of the function of diverse enzymes in environments that mimic cytoplasm, and provides a flexible platform for studying the collective behavior of matter driven far from equilibrium.