ABSTRACT Myosin Va (MyoVa) is a plus-end filamentous-actin motor protein that is highly and broadly expressed in the vertebrate body, including in the nervous system. In excitatory neurons MyoVa transports cargo toward the tip of the dendritic spine, where the post-synaptic density (PSD) is formed and maintained. MyoVa mutations in humans cause neurological dysfunction, mental retardation, hypomelanation and death in infancy or childhood. Here we characterize the Flailer (Flr) mutant mouse, which is homozygous for a myo5a mutation that drives high levels of mutant MyoVa (Flr protein) specifically in the CNS. Flr protein functions as a dominant-negative MyoVa, sequestering cargo and blocking its transport to the PSD. Flr mice have early seizures and mild ataxia, but mature and breed normally. Flr mice display several abnormal behaviors known to be associated with brain regions that show high expression of Flr protein. Flr mice are defective in the transport of synaptic components to the PSD and in mGluR-dependent LTD and have a reduced number of mature dendritic spines. The synaptic and behavioral abnormalities of Flr mice result in an anxiety/autism spectrum disorder (ASD)/obsessive compulsive-like phenotype similar to that of other mouse mutants with similar abnormalities. Because of the dominant-negative nature of the Flr protein, the Flr mouse offers a powerful system for the analysis of how the disruption of synaptic transport and lack of LTD can alter synaptic function, development and wiring of the brain and result in symptoms that characterize many neuropsychiatric disorders. SIGNIFICANCE STATEMENT Here we characterize a mutant mouse homozygous for a Myosin Va mutation named Flailer. The Flailer mutation generates a dominant-negative MyoVa transport motor protein that sequesters synaptic cargo and blocks synaptic transport, thereby resulting in an absence of LTD and in abnormal behaviors similar to those seen anxiety/Autism Spectrum disorders. We propose that the Flailer mutant can be used as a model to study how the absence of LTD disrupts brain connectivity and behavior. Moreover, by using the Flailer mutation together with gene editing technologies it should be possible to target specific brain areas to remove the mutation and recover MyoVa function, thereby interrogating the role of a specific brain region in the control of a particular behavior.

ABSTRACT Neurodevelopmental disorders have been associated with genetic mutations that affect cellular function, including chromatin regulation and epigenetic modifications. Recent studies in humans have identified mutations in KMT2C, an enzyme responsible for modifying histone tails and depositing H3K4me1 and H3K4me3, as being associated with Kleefstra syndrome 2 and autism spectrum disorder (ASD). However, the precise role of KMT2C mutations in brain disorders remains poorly understood. Here we employed CRISPR/Cas9 gene editing to analyze the effects of KMT2C knockout on animal behavior. Knocking out KMT2C expression in cortical neurons and the mouse brain resulted in decreased KMT2C levels. Importantly, KMT2C knockout animals exhibited repetitive behaviors, social deficits, and intellectual disability resembling ASD. Our findings shed light on the involvement of KMT2C in neurodevelopmental processes and establish a valuable model for elucidating the cellular and molecular mechanisms underlying KMT2C mutations and their relationship to Kleefstra syndrome 2 and ASD.

Abstract Background The VPS50 protein functions in synaptic and dense core vesicle acidification, and perturbations of VPS50 function produce behavioral changes in Caenorhabditis elegans . Patients with mutations in VPS50 show severe developmental delay and intellectual disability, characteristics that have been associated with autism spectrum disorders (ASDs). The mechanisms that link VPS50 mutations to ASD are unknown. Results To examine the role of VPS50 in mammalian brain function and behavior, we used the CRISPR/Cas9 system to generate knockouts of VPS50 in both cultured murine cortical neurons and living mice. In cultured neurons, KO of VPS50 did not affect the number of synaptic vesicles but did cause mislocalization of the V-ATPase V1 domain pump and impaired synaptic activity, likely as a consequence of defects in vesicle acidification and vesicle content. In mice, mosaic KO of VPS50 in the hippocampus altered synaptic transmission and plasticity and generated robust cognitive impairments. Conclusions We propose that VPS50 functions as an accessory protein to aid the recruitment of the V-ATPase V1 domain to synaptic vesicles and in that way plays a crucial role in controlling synaptic vesicle acidification. Understanding the mechanisms controlling behaviors and synaptic function in ASD-associated mutations is pivotal for the development of targeted interventions, which may open new avenues for therapeutic strategies aimed at ASD and related conditions.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by the loss of motoneurons (MNs), and despite progress, there is no effective treatment. A large body of evidence shows that astrocytes expressing ALS-linked mutant proteins cause non-cell autonomous toxicity of MNs. Although MNs innervate muscle fibers and ALS is characterized by the early disruption of the neuromuscular junction (NMJ) and axon degeneration, there are controversies about whether muscle contributes to non-cell-autonomous toxicity to MNs. In this study, we generated primary skeletal myotubes from myoblasts derived from ALS mice expressing human mutant SOD1

Abstract Copy number variations, and particularly duplications of genomic regions, have been strongly associated with various neurodegenerative conditions including autism spectrum disorder (ASD). These genetic variations have been found to have a significant impact on brain development and function, which can lead to the emergence of neurological and behavioral symptoms. Developing strategies to target these genomic duplications has been challenging, as the presence of endogenous copies of the duplicate genes often complicates the editing strategies. Using the ASD and anxiety mouse model Flailer, that contains a duplication working as a dominant negative for MyoVa, we demonstrate the use of DN-CRISPRs to remove a 700bp genomic duplication in vitro and in vivo . Importantly, DN-CRISPRs have not been used to remove more gene regions <100bp successfully and with high efficiency. We found that editing the flailer gene in primary cortical neurons reverts synaptic transport and transmission defects. Moreover, long-term depression (LTD), disrupted in Flailer animals, is recovered after gene edition. Delivery of DN-CRISPRs in vivo shows that local delivery to the ventral hippocampus can rescues some of the mutant behaviors, while intracerebroventricular delivery, completely recovers Flailer animal phenotype associated to anxiety and ASD. Our results demonstrate the potential of DN-CRISPR to efficiently (>60% editing in vivo) remove large genomic duplications, working as a new gene therapy approach for treating neurodegenerative diseases.

In the dentate gyrus of the adult hippocampus, neurogenesis from neural stem cells (NSCs) is regulated by Wnt signals from the local microenvironment. The Wnt/β-catenin pathway is active in NSCs, where it regulates proliferation and fate commitment, and subsequently its activity is strongly attenuated. The mechanisms controlling this pattern of activity are poorly understood. In stem cells from adult peripheral tissues, secreted R-spondin proteins (RSPO1-4) interact with LGR4-6 receptors and control Wnt signaling strength. Here, we found that RSPO1-3 and LGR4-6 are expressed in the adult dentate gyrus and in cultured NSCs isolated from the adult mouse hippocampus. The expression of LGR4-5 decreased in NSCs upon differentiation, concomitantly with the reported decrease in Wnt activity. Treatment with RSPO1-3 increased hippocampal NSCs proliferation and the expression of the Wnt target gene Cyclin D1. Moreover, RSPO1-3 were expressed by primary cultures of dentate gyrus astrocytes, a crucial component of the neurogenic niche able to induce NSC proliferation and neurogenesis. In co-culture experiments, astrocyte-induced proliferation of NSCs was prevented by RSPO2 knockdown in astrocytes, and by LGR5 knockdown in hippocampal NSCs. Altogether, our results indicate that RSPO/LGR signaling is present in the dentate niche, where it could control Wnt activity and proliferation of NSCs.

VPS50, is an accessory protein, involved in the synaptic and dense core vesicle acidification and its alterations produce behavioral changes in C.elegans. Here, we produce the mosaic knock out (mKO) of VPS50 using CRISPR/Cas9 system in both cortical cultured neurons and whole animals to evaluate the effect of VPS50 in regulating mammalian brain function and behavior. While mKO of VPS50 does not change the number of synaptic vesicles, it produces a mislocalization of the V-ATPase pump that likely impact in vesicle acidification and vesicle content to impair synaptic and neuronal activity in cultured neurons. In mice, mKO of VPS50 in the hippocampus, alter synaptic transmission and plasticity, and generated robust cognitive impairments associate to memory formation. We propose that VPS50 is an accessory protein that aids the correct recruitment of the V-ATPase pump to synaptic vesicles, thus having a crucial role controlling synaptic vesicle acidification and hence synaptic transmission.