T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive cancer that is frequently associated with activating mutations in NOTCH1 and dysregulation of MYC. Here, we performed 2 complementary screens to identify FDA-approved drugs and drug-like small molecules with activity against T-ALL. We developed a zebrafish system to screen small molecules for toxic activity toward MYC-overexpressing thymocytes and used a human T-ALL cell line to screen for small molecules that synergize with Notch inhibitors. We identified the antipsychotic drug perphenazine in both screens due to its ability to induce apoptosis in fish, mouse, and human T-ALL cells. Using ligand-affinity chromatography coupled with mass spectrometry, we identified protein phosphatase 2A (PP2A) as a perphenazine target. T-ALL cell lines treated with perphenazine exhibited rapid dephosphorylation of multiple PP2A substrates and subsequent apoptosis. Moreover, shRNA knockdown of specific PP2A subunits attenuated perphenazine activity, indicating that PP2A mediates the drug’s antileukemic activity. Finally, human T-ALLs treated with perphenazine exhibited suppressed cell growth and dephosphorylation of PP2A targets in vitro and in vivo. Our findings provide a mechanistic explanation for the recurring identification of phenothiazines as a class of drugs with anticancer effects. Furthermore, these data suggest that pharmacologic PP2A activation in T-ALL and other cancers driven by hyperphosphorylated PP2A substrates has therapeutic potential.

Abstract Genomic rearrangements are a hallmark of most solid tumors, including medulloblastoma, one of the most common brain tumors in children. Childhood cancers involve dysregulated cell development, but their mutational causes remain largely unknown. One of the most common forms of medulloblastoma is caused by ectopic activation of Sonic Hedgehog (SHH) signaling in cerebellar granule cell progenitors, associated with genetic deletions, amplifications, and other oncogenic chromosomal rearrangements. Here, we show that PiggyBac Transposable Element Derived 5 (Pgbd5) promotes tumor development in multiple developmentally-accurate mouse models of SHH medulloblastoma. Most mice with Pgbd5 deficiency do not develop tumors, while Pgbd5 -deficient mice maintain largely normal cerebellar development. Mouse medulloblastomas expressing Pgbd5 exhibit significantly increased numbers of somatic structural DNA rearrangements, with PGBD5-specific transposon sequences at their breakpoints. Similar sequence breakpoints recurrently affect somatic DNA rearrangements of known tumor suppressors and oncogenes in medulloblastomas in 329 children. Therefore, this study identifies PGBD5 as a primary medulloblastoma mutator and provides a genetic mechanism responsible for the generation of somatic oncogenic DNA rearrangements in childhood cancer. One-Sentence Summary Induction of somatic oncogenic mutations by the DNA transposase PGBD5 in cerebellar progenitor cells promotes medulloblastoma development.

Recent advances in nucleic acid sequencing now permit rapid and genome-scale analysis of genetic variation and transcription, enabling population-scale studies of human biology, disease, and diverse organisms. Likewise, advances in mass spectrometry proteomics now permit highly sensitive and accurate studies of protein expression at the whole proteome-scale. However, most proteomic studies rely on consensus databases to match spectra to peptide and proteins sequences, and thus remain limited to the analysis of canonical protein sequences. Here, we develop ProteomeGenerator2 (PG2), based on the scalable and modular ProteomeGenerator framework. PG2 integrates genome and transcriptome sequencing to incorporate protein variants containing amino acid substitutions, insertions, and deletions, as well as non-canonical reading frames, exons, and other variants caused by genomic and transcriptomic variation. We benchmarked PG2 using synthetic data and genomic, transcriptomic, and proteomic analysis of human leukemia cells. PG2 can be integrated with current and emerging sequencing technologies, assemblers, variant callers, and mass spectral analysis algorithms, and is available open-source from https://github.com/kentsisresearchgroup/ProteomeGenerator2 .

Abstract Structural maintenance of chromosomes (SMC) complexes are critical chromatin modulators. In eukaryotes, the cohesin and condensin SMC complexes organize chromatin, while the Smc5/6 complex directly regulates DNA replication and repair. The molecular basis for Smc5/6’s distinct functions is currently poorly understood. Here, we report an integrative structural study of the budding yeast Smc5/6 complex using electron microscopy, cross-linking mass spectrometry, and computational modeling. We show that while the complex shares a similar overall organization with other SMC complexes, it possesses several unique features. In contrast to the reported folded-arm structures of cohesin and condensin, our data suggest that Smc5 and Smc6 arm regions do not fold back on themselves. Instead, these long filamentous regions interact with subunits uniquely acquired by the Smc5/6 complex, namely the Nse2 SUMO ligase and the Nse5-Nse6 subcomplex. Further, we show that Nse5-Nse6 subcomplex adopts a novel structure with an extensive dimerization interface and multiple domains contacting other subunits of the Smc5/6 complex. We also provide evidence that the Nse5-Nse6 module uses its SUMO-binding motifs to contribute to Nse2-mediated sumoylation. Collectively, our integrative multi-scale study identifies distinct structural features of the Smc5/6 complex and functional cooperation amongst its co-evolved unique subunits.

Abstract DNA transposable elements and transposase-derived genes are present in most living organisms, including vertebrates, but their function is largely unknown. PiggyBac Transposable Element Derived 5 (PGBD5) is an evolutionarily conserved vertebrate DNA transposase-derived gene with retained nuclease activity in human cells. Vertebrate brain development is known to be associated with prominent neuronal cell death and DNA breaks, but their causes and functions are not well understood. Here, we show that PGBD5 contributes to normal brain development in mice and humans, where its deficiency causes disorder of intellectual disability, movement, and seizures. In mice, Pgbd5 is required for the developmental induction of post-mitotic DNA breaks and recurrent somatic genome rearrangements. In the brain cortex, loss of Pgbd5 leads to aberrant differentiation and gene expression of distinct neuronal populations, including specific types of glutamatergic neurons, which explains the features of PGBD5 deficiency in humans. Thus, PGBD5 might be a transposase-derived enzyme required for brain development in mammals. One-Sentence Summary PiggyBac Transposable Element Derived 5 (PGBD5) is required for brain development in humans and mice through genetic and epigenetic mechanisms.

Abstract Many human cancers, including acute myeloid leukemia (AML), arise from mutations of stem and progenitor cells. Immunophenotypic profiling has shown that leukemias develop hierarchically, with mutations in leukemia stem cells associated with disease propagation and relapse 1,2 . Although leukemia initiating cells can be enriched using cell surface markers, their frequency tends to be variable and low, obscuring mechanisms and hindering effective therapies 3,4 . To define AML stem cells in human patients, we performed functional genomic profiling of diverse leukemias using label tracing techniques designed to preserve hematopoietic stem cell (HSC) function in vivo. We found that propagation of human AML is mediated by a rare but distinct quiescent label-retaining cell (LRC) population that evades detection by currently known immunophenotypic markers. We show that human AML LRC quiescence is reversible, sparing genetic clonal competition that maintains its epigenetic inheritance. LRC quiescence is defined by distinct promoter-centered chromatin and gene expression dynamics and controlled by a distinct AP-1/ETS transcription factor network, including JUN in particular, which is associated with disease persistence and chemotherapy resistance in diverse patients. These results enable prospective isolation and functional genetic manipulation of immunophenotypically-varied leukemia stem cells in human patient specimens, as well as establish key functions of epigenetic plasticity in leukemia development and therapy resistance. We anticipate that these findings will lead to the elucidation of essential properties of leukemia stem cell quiescence and the design of therapeutic strategies for their clinical identification and control.

Advances in the immunophenotypic and cytogenetic classification of acute leukemias have led to improved clinical outcomes for a substantial fraction of patients. However, resistance to chemotherapy remains a major barrier to cure for patients with specific subsets of acute myeloid and lymphoblastic leukemias. Here, we propose that a molecularly distinct subtype of acute leukemia with shared myeloid and T-cell lymphoblastic features, which we term acute myeloid/T-lymphoblastic leukemia (AMTL), and has been divided between 3 diagnostic categories owing to variable expression of markers deemed to be defining of myeloid and T-cell lymphoid lineages. This new diagnostic group is supported by the i) shared hematopoietic ontogeny in which myeloid differentiation potential is specifically retained during early T-cell lymphoid development, ii) recognition of cases of AML with hallmarks of T-cell development such as clonal rearrangements of the T-cell receptor genes, and iii) identification of common gene mutations in subsets of AML and T-ALL cases. This proposed diagnostic entity overlaps with early T-cell precursor (ETP) T-ALL and T-cell/myeloid mixed phenotype acute leukemias (MPAL), and also includes a subset of leukemias currently classified as AML with hallmarks of T-lymphoblastic development. AMTLs express variable levels of both T-cell and myeloid-specific markers, such as CD3 and myeloperoxidase, and additionally have shared gene mutations including WT1, PHF6, RUNX1 and BCL11B. The proposed classification of AMTL as a distinct entity should enable prospective diagnosis and development of improved therapies for patients whose treatment is inadequate with current approaches.

Despite intense efforts, the cure rates of childhood and adult solid tumors are not satisfactory. Resistance to intensive chemotherapy is common, and targets for molecular therapies are largely undefined. We have now found that the majority of childhood solid tumors, including rhabdoid tumors, neuroblastoma, medulloblastoma and Ewing sarcoma, express an active DNA transposase PGBD5 that can promote site-specific genomic rearrangements in human cells. Using functional genetic approaches, we found that mouse and human cells deficient in nonhomologous end joining (NHEJ) DNA repair cannot tolerate the expression of PGBD5. In a chemical screen of DNA damage signaling inhibitors, we identified AZD6738 as a specific sensitizer of PGBD5-dependent DNA damage and apoptosis. We found that expression of PGBD5, but not its nuclease activity-deficient mutant, was sufficient to induce hypersensitivity to AZD6738. Depletion of endogenous PGBD5 conferred resistance to AZD6738 in human tumor cells. PGBD5-expressing tumor cells accumulated unrepaired DNA damage in response to AZD6738 treatment, and underwent apoptosis in both dividing and G1 phase cells in the absence of immediate DNA replication stress. Accordingly, AZD6738 exhibited nanomolar potency against the majority of neuroblastoma, medulloblastoma, Ewing sarcoma and rhabdoid tumor cells tested, while sparing non transformed human and mouse embryonic fibroblasts in vitro. Finally, treatment with AZD6738 induced apoptosis and regression of human neuroblastoma and medulloblastoma tumors engrafted in immunodeficient mice in vivo. This effect was potentiated by combined treatment with cisplatin, including significant anti-tumor activity against patientderived primary neuroblastoma xenografts. These findings delineate a therapeutically actionable synthetic dependency induced in PGBD5-expressing solid tumors.

Modern mass spectrometry now permits genome-scale and quantitative measurements of biological proteomes. However, analyses of specific specimens are currently hindered by the incomplete representation of biological variability of protein sequences in canonical reference proteomes, and the technical demands for their construction. Here, we report ProteomeGenerator, a framework for de novo and reference-assisted proteogenomic database construction and analysis based on sample-specific transcriptome sequencing and high resolution and high-accuracy mass spectrometry proteomics. This enables assembly of proteomes encoded by actively transcribed genes, including sample-specific protein isoforms resulting from non-canonical mRNA transcription, splicing, or editing. To improve the accuracy of protein isoform identification in non-canonical proteomes, ProteomeGenerator relies on statistical target-decoy database matching augmented with spectral-match calibrated sample-specific controls. We applied this method for the proteogenomic discovery of splicing factor SRSF2-mutant leukemia cells, demonstrating high-confidence identification of non-canonical protein isoforms arising from alternative transcriptional start sites, intron retention, and cryptic exon splicing, as well as improved accuracy of genome-scale proteome discovery. Additionally, we report proteogenomic performance metrics for the current state-of-the-art implementations of SEQUEST HT, Proteome Discoverer, MaxQuant, Byonic, and PEAKS mass spectral analysis algorithms. Finally, ProteomeGenerator is implemented as a Snakemake workflow, enabling open, scalable, and facile discovery of sample-specific, non-canonical and neomorphic biological proteomes (https://github.com/jtpoirier/proteomegenerator).