Abstract Cells must replicate and segregate their DNA with precision. In eukaryotes, these processes are part of a regulated cell-cycle that begins at S-phase with the replication of DNA and ends after M-phase. Previous studies showed that these processes were present in the last eukaryotic common ancestor and the core parts of their molecular systems are conserved across eukaryotic diversity. However, some unicellular parasites, such as the metamonad Giardia intestinalis , have secondarily lost components of the DNA processing and segregation apparatuses. To clarify the evolutionary history of these systems in these unusual eukaryotes, we generated a high-quality draft genome assembly for the free-living metamonad Carpediemonas membranifera and carried out a comparative genomics analysis. We found that parasitic and free-living metamonads harbor a conspicuously incomplete set of canonical proteins for processing and segregating DNA. Unexpectedly, Carpediemonas species are further streamlined, lacking the origin recognition complex, Cdc6 and other replisome components, most structural kinetochore subunits including the Ndc80 complex, as well as several canonical cell-cycle checkpoint proteins. Carpediemonas is the first eukaryote known to have lost this large suite of conserved complexes, suggesting that it has a highly unusual cell cycle and that unlike any other known eukaryote, it must rely on novel or alternative set of mechanisms to carry out these fundamental processes.

Metamonads are a diverse group of heterotrophic microbial eukaryotes adapted to living in hypoxic environments. All metamonads but one harbour metabolically altered 'mitochondrion-related organelles' (MROs) with reduced functions, however the degree of reduction varies. Here, we generate high-quality draft genomes, transcriptomes, and predicted proteomes for five recently discovered free-living metamonads. Phylogenomic analyses placed these organisms in a group we name the 'BaSk' (Barthelonids+Skoliomonads) clade, a deeply branching sister group to the Fornicata, a phylum that includes parasitic and free-living flagellates. Bioinformatic analyses of gene models shows that these organisms are predicted to have extremely reduced MRO proteomes in comparison to other free-living metamonads. Loss of the mitochondrial iron-sulfur cluster assembly system in some organisms in this group appears to be linked to the acquisition in their common ancestral lineage of a SUF-like minimal system Fe/S cluster pathway by lateral gene transfer. One of the isolates, Skoliomonas litria, appears to have lost all other known MRO pathways. No proteins were confidently assigned to the predicted MRO proteome of this organism suggesting that the organelle has been lost. The extreme mitochondrial reduction observed within this free-living anaerobic protistan clade demonstrates that mitochondrial functions may be completely lost even in free-living organisms.

Abstract Symbiotic relationships drive evolutionary change and are important sources of novelty. Here we demonstrate a highly structured syntrophic symbiosis between species of the anaerobic protist Anaeramoeba (Anaeramoebae, Metamonada) and bacterial ectosymbionts. We dissected this symbiosis with long-read metagenomics, transcriptomics of host and symbiont cells coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), and microscopy. Genome sequencing, phylogenomic analyses and FISH show that the symbionts belong to the Desulfobacteraceae and were acquired independently in two different Anaeramoeba species. We show that ectosymbionts likely reside deep within cell surface invaginations in a symbiosomal membrane network that is tightly associated with cytoplasmic hydrogenosomes. Metabolic reconstructions based on the genomes and transcriptomes of the symbionts suggest a highly evolved syntrophic interaction. Host hydrogenosomes likely produce hydrogen, acetate, and propionate that are consumed by the symbionts dissimilatory sulfate reduction, Wood-Ljungdahl and methylmalonyl pathways, respectively. Because the host genome sequences encode several vitamin B12-dependent enzymes but appear to lack the ability to biosynthesize this vitamin, we hypothesize that the symbionts supply their hosts with B12. We detected numerous lateral gene transfers from diverse bacteria to Anaeramoeba , including genes involved in oxygen defense and anaerobic metabolism. Gene families encoding membrane-trafficking components that regulate the phagosomal maturation machinery are notably expanded in Anaeramoeba spp. and may be involved in organizing and/or stabilizing the symbiosomal membrane system. Overall, the Anaeramoebae have evolved a dynamic symbiosome comprised of a vacuolar system that facilitates positioning and maintenance of sulfate-reducing bacterial ectosymbionts.

Abstract Giardia lamblia encode several families of cysteine-rich proteins. Among these families are the Variant-specific Surface Proteins (VSPs), which are involved in the process of antigenic variation. In addition to VSPs, other Cys-rich proteins have been described, such as High Cysteine Membrane Proteins (HCMPs), High Cysteine Proteins (HCPs) and Tenascin-like Proteins (TLPs). However, these proteins are less characterized and there is no consensus on their subcellular localization, function, expression, and relationship with the VSPs. Although numerous efforts have been made to determine the distinctive characteristics of VSPs and the number of VSP genes present in the genome of Giardia , a clear profile of the VSP repertoire is still lacking. Here, we performed an exhaustive analysis of the Cys-rich families in the recently updated version of the Giardia genome, including their organization, characteristic features, evolution and levels of expression, by combining simple pattern searches and predictions with massive sequencing techniques, integrating and reanalyzing as much omics data as possible. We propose a new classification for the Cys-rich protein-encoding genes and pseudogenes that better describes their involvement in the parasite biology and define unique characteristics of the VSPs that include, besides their known features, an Initiator element/Kozak-like sequence, an extended polyadenylation signal and a unique pattern of mutually exclusive transcript accumulation. Our findings also imply that the HCMPs (now named Cys-Rich Membrane Proteins, CRMPs) are upregulated under stress conditions and might protect the parasite during VSP switching. These results contribute to a better understanding of the process of antigenic variation in this pathogen. Author Summary The most common cause of parasite-induced diarrhea is Giardia lamblia . This intestinal parasite causes 180 million cases of symptomatic disease (giardiasis) yearly but also many asymptomatic infections, resulting in that more than 0.5 billion people are currently colonized by the parasite. One key virulence mechanism of G. lamblia , resulting in long-term infections and frequent re-infections, is antigenic variation of Variant-specific Surface Proteins (VSPs). The cysteine-rich VSP proteins are encoded by a multi-gene family but until now the number of genes and how they are regulated has been unclear. Here a recently assembled Giardia reference genome was analyzed using different bioinformatic analyses and this revealed that there are 136 VSP genes in the Giardia genome. The analyses revealed that there are additional cysteine rich proteins in gene families with fewer members that are related to VSPs but with other roles than antigenic variation. A large number of incomplete VSP genes were also identified and they can function as a sequence reservoir for generation of VSP variability. The VSP genes have unique regulatory elements in the upstream and downstream regions, suggesting a role in regulation. Several gene expression data sets were re-analyzed and it showed that one major VSP is expressed per cell. This study is the first to reveal the organization of VSPs in Giardia and it will be the basis for further studies of the mechanism of antigenic variation in this important intestinal parasite.

Summary ‘Kingdom-level’ branches are being added to the tree of eukaryotes at a rate approaching one per year, with no signs of slowing down 1–4 . Some are completely new discoveries, while others are morphologically unusual protists that were previously described but lacked molecular data. For example, Hemimastigophora are predatory protists with two rows of flagella that were known since the 19 th century, but proved to represent a new deep-branching eukaryote lineage when phylogenomic analyses were conducted 2 . Meteora sporadica Hausmann et al. 2002 5 is a protist with a unique morphology and motility; cells glide over substrates along a long axis of anterior and posterior projections, and have a pair of lateral ‘arms’ that swing back and forth. Originally, Meteora was described by light microscopy only, from a short-term enrichment of deep-sea sediment. A small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) sequence was reported recently, but the phylogenetic placement of Meteora remained unresolved 6 . Here, we investigated two cultivated Meteora sporadica isolates in detail. Transmission electron microscopy showed that the anterior-posterior projections are supported by microtubules originating from a cluster of subnuclear MTOCs. Likewise, the arms are supported by microtubules, and neither have a flagellar axoneme-like structure. Sequencing the mitochondrial genome showed this to be amongst the most gene-rich known, outside jakobids. Remarkably, phylogenomic analyses of 254 nuclear protein-coding genes robustly support a close relationship with Hemimastigophora. Our study suggests that Meteora and Hemimastigophora together represent a morphologically diverse ‘supergroup’, and thus are important for resolving the tree of eukaryote life and early eukaryote evolution.

Abstract The first SAM degrading enzyme (SAMase) was discovered in bacteriophage T3, as a counter-defense against the bacterial restriction-modification system, and annotated as an S-adenosyl-L-methionine (SAM) hydrolase forming 5’-methyl-thioadenosine (MTA) and L-homoserine. From environmental phages, we recently discovered three SAMases with barely detectable sequence similarity to T3 SAMase and without homology to proteins of known structure. Here, we present the very first phage SAMase structures, in complex with a substrate analogue and the product MTA. The structure shows a trimer of alpha-beta sandwiches similar to the GlnB-like superfamily, with active sites formed at the trimer interfaces. Quantum-mechanical calculations, thin-layer chromatography and NMR spectroscopy demonstrate that this family of enzymes are not hydrolases but lyases forming MTA and L-homoserine lactone in a unimolecular reaction mechanism. Sequence analysis, in vitro and in vivo mutagenesis support that T3 SAMase belongs to the same structural family and utilizes the same reaction mechanism.

Dicytostelium firmibasis is a member of Dictyostelia, a group of social amoebae that upon starvation display aggregative multicellularity where the amoebae transition from uni- to multicellular life. The D. firmibasis genome assembly that is currently available is of limited use due to its low contiguity, large number of undetermined bases, and lack of annotations. Here we used Nanopore long read sequencing, complemented with Illumina sequencing, and developmental transcriptomics as well as small RNA-sequencing, to present a new, fully annotated, chromosome-level D. firmibasis genome assembly. The new assembly contains no undetermined bases, and consists mainly of six large contigs representing the chromosomes, as well as a complete mitochondrial genome. This new genome assembly will be a valuable tool, allowing comprehensive comparison to Dictyostelium discoideum, the dictyostelid genetically tractable model. Further, the new genome will be important for studies of evolutionary processes governing the transition from unicellular to multicellular organisms and will aid in the sequencing and annotation of other dictyostelids genomes, many of which are currently of poor quality.

Diplomonad parasites of the genus Giardia have adapted to colonizing different hosts, most notably the intestinal tract of mammals. The human-pathogenic Giardia species, Giardia intestinalis , has been extensively studied at the genome and gene expression level, but no such information is available for other Giardia species. Comparative data would be particularly valuable for Giardia muris , which colonizes mice and is commonly used as a prototypic in vivo model for investigating host responses to intestinal parasitic infection. Here we report the draft-genome of G. muris . We discovered a highly streamlined genome, amongst the most densely encoded ever described for a nuclear eukaryotic genome. G. muris and G. intestinalis share many known or predicted virulence factors, including cysteine proteases and a large repertoire of cysteine-rich surface proteins involved in antigenic variation. Different to G. intestinalis , G. muris maintains tandem arrays of pseudogenized surface antigens at the telomeres, whereas intact surface antigens are present centrally in the chromosomes. The two classes of surface antigens engage in genetic exchange. Reconstruction of metabolic pathways from the G. muris genome suggest significant metabolic differences to G. intestinalis . Additionally, G. muris encodes proteins that might be used to modulate the prokaryotic microbiota. The responsible genes have been introduced in the Giardia genus via lateral gene transfer from prokaryotic sources. Our findings point to important evolutionary steps in the Giardia genus as it adapted to different hosts and it provides a powerful foundation for mechanistic exploration of host-pathogen interaction in the G. muris - mouse pathosystem.

Abstract Metamonads are a diverse group of heterotrophic microbial eukaryotes adapted to living in hypoxic environments. All metamonads but one harbour metabolically altered ‘mitochondrion-related organelles’ (MROs) with reduced functions relative to aerobic mitochondria, however the degree of reduction varies markedly over the metamonad tree. To further investigate metamonad MRO diversity, we generated high quality draft genomes, transcriptomes, and predicted proteomes for five recently discovered free-living metamonads. Phylogenomic analyses place these organisms in a clade sister to the Fornicata – a group of metamonads that includes parasitic and free-living diplomonads and Carpediemonas -like organisms. Extensive bioinformatic analyses of the manually curated gene models showed that these organisms have extremely reduced MROs in comparison to other free-living metamonads. Loss of the mitochondrial iron-sulfur cluster (ISC) assembly system in some organisms in this group appears to be linked to the acquisition in their common ancestral lineage of a SUF-like minimal system (SMS) Fe/S cluster pathway through lateral gene transfer (LGT). One of the isolates, named ‘RC’, appears to have undergone even more drastic mitochondrial reduction losing almost all other detectable MRO-related functions. The extreme mitochondrial reduction observed within this free-living anaerobic protistan clade is unprecedented and demonstrates that mitochondrial functions, under some conditions, can be almost completely lost even in free-living organisms.

ABSTRACT Increasing numbers of small proteins with diverse physiological roles are being identified and characterized in both prokaryotic and eukaryotic systems, but the origins and evolution of these proteins remain unclear. Recent genomic sequence analyses in several organisms suggest that new functions encoded by small open reading frames (sORFs) may emerge de novo from noncoding sequences. However, experimental data demonstrating if and how randomly generated sORFs can confer beneficial effects to cells are limited. Here we show that by up-regulating hisB expression, de novo small proteins (≤ 50 amino acids in length) selected from random sequence libraries can rescue Escherichia coli cells that lack the conditionally essential SerB enzyme. The recovered small proteins are hydrophobic and confer their rescue effect by binding to the 5’ end regulatory region of the his operon mRNA, suggesting that protein binding promotes structural rearrangements of the RNA that allow increased hisB expression. This study adds RNA regulatory elements as another interacting partner for de novo proteins isolated from random sequence libraries, and provides further experimental evidence that small proteins with selective benefits can originate from the expression of nonfunctional sequences.