Summary Phenotypic plasticity is essential to the immune system, yet the factors that shape it are not fully understood. Here, we comprehensively analyze immune cell phenotypes including morphology across human cohorts by single-round multiplexed immunofluorescence, automated microscopy, and deep learning. Using the uncertainty of convolutional neural networks to cluster the phenotypes of 8 distinct immune cell subsets, we find that the resulting maps are influenced by donor age, gender, and blood pressure, revealing distinct polarization and activation-associated phenotypes across immune cell classes. We further associate T-cell morphology to transcriptional state based on their joint donor variability, and validate an inflammation-associated polarized T-cell morphology, and an age-associated loss of mitochondria in CD4 + T-cells. Taken together, we show that immune cell phenotypes reflect both molecular and personal health information, opening new perspectives into the deep immune phenotyping of individual people in health and disease.

After antigen stimulation, naïve T cells display reproducible population-level responses, which arise from individual T cells pursuing specific differentiation trajectories. However, cell-intrinsic predeterminants controlling these single-cell decisions remain enigmatic. We found that the subcellular architectures of naïve CD8 T cells, defined by the presence (T Ø ) or absence (T O ) of nuclear envelope invaginations, changed with maturation, activation, and differentiation. Upon T cell receptor (TCR) stimulation, naïve T Ø cells displayed increased expression of the early-response gene Nr4a1 , dependent upon heightened calcium entry. Subsequently, in vitro differentiation revealed that T Ø cells generated effector-like cells more so compared with T O cells, which proliferated less and preferentially adopted a memory-precursor phenotype. These data suggest that cellular architecture may be a predeterminant of naïve CD8 T cell fate.

Abstract Background and Objectives Mixed-field agglutination in ABO phenotyping (A 3 , B 3 ) has been linked to genetically different blood cell populations like in chimerism, or to rare variants in either ABO exon 7 or regulatory regions. Clarification of such cases is challenging and would greatly benefit from sequencing technologies that allow resolving full-gene haplotypes at high resolution. Materials and Methods We used long-read sequencing by Oxford Nanopore Technologies to sequence the entire ABO gene, amplified in two overlapping long-range PCR fragments, in a blood donor presented with A 3 B phenotype. Confirmation analyses were carried out by Sanger sequencing and included samples from other family members. Results Our data revealed a novel heterozygous g.10924C>A variant on the ABO*A -allele located in the transcription factor binding site for RUNX1 in intron 1 (+5.8 kb site). Inheritance was shown by the results of the donor’s mother, who shared the novel variant and the anti-A specific mixed-field agglutination. Conclusion We discovered a regulatory variant in the 8-bp RUNX1 motif of ABO , which extends current knowledge of three other variants affecting the same motif and also leading to A 3 or B 3 phenotypes. Overall, long-range PCR combined with nanopore sequencing proved powerful and showed great potential as emerging strategy for resolving cases with cryptic ABO phenotypes.

Abstract Due to substantial improvement in read accuracy, third-generation long-read sequencing holds great potential in blood group diagnostics, particularly in cases where traditional genotyping or sequencing techniques, primarily targeting exons, are unable to explain serologic phenotypes. In this study, we employed Oxford Nanopore sequencing to resolve all genotype-phenotype discrepancies in the Kidd blood group system (JK, SLC14A1 ) observed over seven years of routine high-throughput donor genotyping using a mass spectrometry based platform at Blood Transfusion Service Zurich. Discrepant results of standard serological typing and donor genotyping were confirmed by commercial PCR-SSP kits. To resolve discrepancies, we amplified the entire coding region of SLC14A1 (∼24 kb, exons 3 to 10) in two overlapping long-range PCRs in all samples. Amplicons were barcoded and sequenced on a MinION flow cell. Sanger sequencing and bridge-PCRs were used to confirm findings. Among 11,972 donors who had both serology and genotypic data available for the Kidd system, we identified 10 cases with unexplained conflicting results. Five were linked to known weak and null alleles caused by variants not included in the routine donor genotyping. In two cases, we identified novel null alleles on the JK*01 (Gly40Asp; c.119G>A) and JK*02 (Gly242Glu; c.725G>A) haplotype, respectively. Remarkably, the remaining three cases were linked to a yet unknown deletion of ∼5 kb spanning over exon 9-10 of the JK*01 allele, which other molecular methods had failed to detect. Overall, nanopore sequencing demonstrated reliable and accurate performance for detecting both single nucleotide and structural variants. It possesses the potential to become a robust tool in the molecular diagnostic portfolio, particularly for addressing challenging structural variation such as hybrid genes, deletions and duplications.