Glucose is a critical component in the proinflammatory response of macrophages (MΦs). However, the contribution of glucose transporters (GLUTs) and the mechanisms regulating subsequent glucose metabolism in the inflammatory response are not well understood. Because MΦs contribute to obesity-induced inflammation, it is important to understand how substrate metabolism may alter inflammatory function. We report that GLUT1 (SLC2A1) is the primary rate-limiting glucose transporter on proinflammatory-polarized MΦs. Furthermore, in high fat diet-fed rodents, MΦs in crown-like structures and inflammatory loci in adipose and liver, respectively, stain positively for GLUT1. We hypothesized that metabolic reprogramming via increased glucose availability could modulate the MΦ inflammatory response. To increase glucose uptake, we stably overexpressed the GLUT1 transporter in RAW264.7 MΦs (GLUT1-OE MΦs). Cellular bioenergetics analysis, metabolomics, and radiotracer studies demonstrated that GLUT1 overexpression resulted in elevated glucose uptake and metabolism, increased pentose phosphate pathway intermediates, with a complimentary reduction in cellular oxygen consumption rates. Gene expression and proteome profiling analysis revealed that GLUT1-OE MΦs demonstrated a hyperinflammatory state characterized by elevated secretion of inflammatory mediators and that this effect could be blunted by pharmacologic inhibition of glycolysis. Finally, reactive oxygen species production and evidence of oxidative stress were significantly enhanced in GLUT1-OE MΦs; antioxidant treatment blunted the expression of inflammatory mediators such as PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), suggesting that glucose-mediated oxidative stress was driving the proinflammatory response. Our results indicate that increased utilization of glucose induced a ROS-driven proinflammatory phenotype in MΦs, which may play an integral role in the promotion of obesity-associated insulin resistance. Glucose is a critical component in the proinflammatory response of macrophages (MΦs). However, the contribution of glucose transporters (GLUTs) and the mechanisms regulating subsequent glucose metabolism in the inflammatory response are not well understood. Because MΦs contribute to obesity-induced inflammation, it is important to understand how substrate metabolism may alter inflammatory function. We report that GLUT1 (SLC2A1) is the primary rate-limiting glucose transporter on proinflammatory-polarized MΦs. Furthermore, in high fat diet-fed rodents, MΦs in crown-like structures and inflammatory loci in adipose and liver, respectively, stain positively for GLUT1. We hypothesized that metabolic reprogramming via increased glucose availability could modulate the MΦ inflammatory response. To increase glucose uptake, we stably overexpressed the GLUT1 transporter in RAW264.7 MΦs (GLUT1-OE MΦs). Cellular bioenergetics analysis, metabolomics, and radiotracer studies demonstrated that GLUT1 overexpression resulted in elevated glucose uptake and metabolism, increased pentose phosphate pathway intermediates, with a complimentary reduction in cellular oxygen consumption rates. Gene expression and proteome profiling analysis revealed that GLUT1-OE MΦs demonstrated a hyperinflammatory state characterized by elevated secretion of inflammatory mediators and that this effect could be blunted by pharmacologic inhibition of glycolysis. Finally, reactive oxygen species production and evidence of oxidative stress were significantly enhanced in GLUT1-OE MΦs; antioxidant treatment blunted the expression of inflammatory mediators such as PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), suggesting that glucose-mediated oxidative stress was driving the proinflammatory response. Our results indicate that increased utilization of glucose induced a ROS-driven proinflammatory phenotype in MΦs, which may play an integral role in the promotion of obesity-associated insulin resistance.

The transcription factor Runx3 is identified as a central regulator of the development of tissue-resident memory CD8+ T cells, providing insights into the signals that promote T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Memory T cells that reside in tissues around the body are positioned at points that are commonly exposed to pathogens, ready to launch their immune response. However, the molecular signals that control their activity here are not well understood. In this study Ananda Goldrath and co-workers identify the transcription factor Runx3 as a key regulator of the development and functionality of tissue-resident memory CD8+ T cells. They provide evidence that supports the establishment of a residence-fate commitment early during CD8+ T cell differentiation. Tissue-resident memory CD8+ T (TRM) cells are found at common sites of pathogen exposure, where they elicit rapid and robust protective immune responses1,2. However, the molecular signals that control TRM cell differentiation and homeostasis are not fully understood. Here we show that mouse TRM precursor cells represent a unique CD8+ T cell subset that is distinct from the precursors of circulating memory cell populations at the levels of gene expression and chromatin accessibility. Using computational and pooled in vivo RNA interference screens, we identify the transcription factor Runx3 as a key regulator of TRM cell differentiation and homeostasis. Runx3 was required to establish TRM cell populations in diverse tissue environments, and supported the expression of crucial tissue-residency genes while suppressing genes associated with tissue egress and recirculation. Furthermore, we show that human and mouse tumour-infiltrating lymphocytes share a core tissue-residency gene-expression signature with TRM cells that is associated with Runx3 activity. In a mouse model of adoptive T cell therapy for melanoma, Runx3-deficient CD8+ tumour-infiltrating lymphocytes failed to accumulate in tumours, resulting in greater rates of tumour growth and mortality. Conversely, overexpression of Runx3 enhanced tumour-specific CD8+ T cell abundance, delayed tumour growth, and prolonged survival. In addition to establishing Runx3 as a central regulator of TRM cell differentiation, these results provide insight into the signals that promote T cell residency in non-lymphoid sites, which could be used to enhance vaccine efficacy or adoptive cell therapy treatments that target cancer.

Abstract Individual naive CD8 T cells activated in lymphoid organs differentiate into functionally diverse and anatomically distributed T cell phylogenies in response to intracellular microbes. During infections that resolve rapidly, including live viral vaccines 1 , distinct effector (T EFF ) and memory (T MEM ) cell populations develop that ensure long term immunity 2 . During chronic infections, responding cells progressively become dysfunctional and “exhaust” 3 . A diverse taxonomy of T EFF , T MEM and exhausted (T EX ) CD8 T cell populations is known, but the initial developmental basis of this phenotypic variation remains unclear 4–10 . Here, we defined single-cell trajectories and identified chromatin regulators that establish antiviral CD8 T cell heterogeneity using unsupervised analyses of single-cell RNA dynamics 11–13 and an in vivo RNAi screen 14 . Activated naive cells differentiate linearly into uncommitted effector-memory progenitor (EMP) cells, which initially branch into an analogous manifold during either acute or chronic infection. Disparate RNA velocities in single EMP cells initiate divergence into stem, circulating, and tissue-resident memory lineages that generate diverse T MEM and T EX precursor states in specific developmental orders. Interleukin-2 receptor (IL-2R) signals are essential for formation and transcriptional heterogeneity of EMP cells, and promote trajectories toward T EFF rather than T EX states. Nucleosome remodelers Smarca4 and Chd7 differentially promote transcription that delineates divergent T MEM lineages before cooperatively driving terminal T EFF cell differentiation. Thus, the lineage architecture is established by specific chromatin regulators that stabilize diverging transcription in uncommitted progenitors.

Abstract Memory CD8 T cells provide durable protection against diverse intracellular pathogens and can be broadly segregated into distinct circulating and tissue-resident populations. Paradigmatic studies have demonstrated circulating memory cells can be further divided into effector memory (T em ) and central memory (T cm ) populations based on discrete functional characteristics. Following resolution of infection, we identified a persisting antigen-specific CD8 T cell population that was simultaneously terminally-fated with potent effector function but maintained memory T cell qualities and conferred robust protection against reinfection. Notably, this terminally-differentiated effector memory CD8 T cell population (terminal-T em ) was conflated within the conventional T em population, prompting redefinition of the classical characteristics of T em cells. Murine terminal-T em were transcriptionally, functionally, and developmentally unique compared to T em cells. Through mass cytometry and single-cell RNAseq analyses of human peripheral blood from healthy individuals, we also identified an analogous terminal-T em population of CD8 T cells that was transcriptionally distinct from T em and T cm . A key finding of this study was that parsing of terminal-T em from conventionally defined T em challenges classical characteristics of T em biology, including enhanced presence in lymphoid tissues, robust IL-2 production and recall potential, greater than expected homeostatic fitness, refined transcription factor dependencies, and a distinct molecular phenotype. Classification of terminal-T em and clarification of T em biology hold broad implications for understanding the molecular regulation of memory cell states and harnessing immunological memory to improve immunotherapies.

Summary The efficacy of cancer immunotherapies is limited by the metabolic instability of the tumor microenvironment (TME) that disables T cell antitumor immunity. Metabolic imbalances within the TME are sensed and responded to by stress sensors of the endoplasmic reticulum (ER) unfolded protein response (UPR). The UPR comprises three integrated signaling pathways harboring both adaptive and deleterious phases based on the extent and duration of cell stress. Here, we elucidate the differential contributions of adaptive and deleterious signaling downstream of the UPR IRE1 pathway in T cell-regulated tumor control. T cells in murine and patient cancers experience persistent ER stress, leading to hyperactive IRE1 signaling that limits tumor control. However, amplifying the adaptive arm of the IRE1 UPR serves to eliminate mitochondrial toxicity and protect T cells from chronic ER stress, yielding robust tumor engraftment and long-term tumor immunity. Our findings establish the UPR’s essential protective role in antitumor immunity.

Abstract Resident Memory T cells (TRM) play a vital role in regional immune defense in barrier organs. Although laboratory rodents have been extensively used to study fundamental TRM biology, poor isolation efficiency, sampling bias and low cell survival rates have limited our ability to conduct TRM-focused high-throughput assays. Here, we engineered a murine vaginal epithelial organoid (VEO)-CD8 T cell co-culture system that supports CD8 TRM differentiation in vitro . The three-dimensional VEOs established from murine adult stem cells resembled stratified squamous vaginal epithelium and induced gradual differentiation of activated CD8 T cells into epithelial TRM. These in vitro generated TRM were phenotypically and transcriptionally similar to in vivo TRM, and key tissue residency features were reinforced with a second cognate-antigen exposure during co-culture. TRM differentiation was not affected even when VEOs and CD8 T cells were separated by a semipermeable barrier, indicating soluble factors’ involvement. Pharmacological and genetic approaches showed that TGF-β signaling played a crucial role in their differentiation. We found that the VEOs in our model remained susceptible to viral infections and the CD8 T cells were amenable to genetic manipulation; both of which will allow detailed interrogation of antiviral CD8 T cell biology in a reductionist setting. In summary, we established a robust model which captures bonafide TRM differentiation that is scalable, open to iterative sampling, and can be subjected to high throughput assays that will rapidly add to our understanding of TRM.

Resident memory T cells (TRMs) play a vital role in regional immune defense. Although laboratory rodents have been extensively used to study fundamental TRM biology, poor isolation efficiency and low cell survival rates have limited the implementation of TRM-focused high-throughput assays. Here, we engineer a murine vaginal epithelial organoid (VEO)-CD8 T cell co-culture system that supports CD8 TRM differentiation. These in-vitro-generated TRMs are phenotypically and transcriptionally similar to in vivo TRMs. Pharmacological and genetic approaches showed that transforming growth factor β (TGF-β) signaling plays a crucial role in their differentiation. The VEOs in our model are susceptible to viral infections and the CD8 T cells are amenable to genetic manipulation, both of which will allow a detailed interrogation of antiviral CD8 T cell biology. Altogether we have established a robust in vitro TRM differentiation system that is scalable and can be subjected to high-throughput assays that will rapidly add to our understanding of TRMs.

Unremitting defense against diverse pathogens and malignancies requires a dynamic and durable immune response. Tissue-resident memory CD8 T cells (Trm) afford robust protection against infection and cancer progression through continuous surveillance of non-lymphoid tissues. Here, we provide insight into how Trm confer potent and persistent immunity through partitioning of distinct cellular subsets differing in longevity, effector function, and multipotency. Antigen-specific CD8 T cells localized to the epithelium of the small intestine are primarily comprised of a shorter-lived effector population most prominent early following both acute viral and bacterial infections, and a longer-lived Id3hi Trm population that subsequently accumulates at later memory timepoints. We define regulatory gene-programs driving these distinct Trm states, and further clarify roles for Blimp1, T-bet, Id2, and Id3 in supporting and maintaining intestinal Trm heterogeneity during infection. Further, through single-cell RNAseq analysis we demonstrate that tumor-infiltrating lymphocytes broadly differentiate into discrete populations of short-lived and long-lived Trm-like subsets, which share qualities with terminally-exhausted and progenitor-exhausted cells, respectively. As the clinical relevance of Trm continues to widen from acute infections to settings of chronic inflammation and malignancy, clarification of the spectrum of phenotypic and functional states exhibited by CD8 T cells that reside in non-lymphoid tissues will provide a framework for understanding their regulation and identity in diverse pathophysiological contexts.

Abstract Single-cell technologies can readily measure the expression of thousands of molecular features from individual cells undergoing dynamic biological processes, such as cellular differentiation, immune response, and disease progression. While examining cells along a computationally ordered pseudotime offers the potential to study how subtle changes in gene or protein expression impact cell fate decision-making, identifying characteristic features that drive continuous biological processes remains difficult to detect from unenriched and noisy single-cell data. Given that all profiled sources of feature variation contribute to the cell-to-cell distances that define an inferred cellular trajectory, including confounding sources of biological variation (e.g. cell cycle or metabolic state) or noisy and irrelevant features (e.g. measurements with low signal-to-noise ratio) can mask the underlying trajectory of study and hinder inference. Here, we present DELVE (dynamic selection of locally covarying features), an unsupervised feature selection method for identifying a representative subset of dynamically-expressed molecular features that recapitulates cellular trajectories. In contrast to previous work, DELVE uses a bottom-up approach to mitigate the effect of unwanted sources of variation confounding inference, and instead models cell states from dynamic feature modules that constitute core regulatory complexes. Using simulations, single-cell RNA sequencing data, and iterative immunofluorescence imaging data in the context of the cell cycle and cellular differentiation, we demonstrate that DELVE selects features that more accurately characterize cell populations and improve the recovery of cell type transitions. This feature selection framework provides an alternative approach for improving trajectory inference and uncovering co-variation amongst features along a biological trajectory. DELVE is implemented as an open-source python package and is publicly available at: https://github.com/jranek/delve .

During an immune response to microbial infection, CD8+ T cells give rise to distinct classes of cellular progeny that coordinately mediate clearance of the pathogen and provide long-lasting protection against reinfection, including a subset of non-circulating tissue-resident memory (TRM) cells that mediate potent protection within non-lymphoid tissues. Here, we utilized single-cell RNA-sequencing to examine the gene expression patterns of individual CD8+ T cells in the spleen and small intestine intraepithelial lymphocyte (siIEL) compartment throughout the course of their differentiation in response to viral infection. These analyses revealed previously unknown transcriptional heterogeneity within the siIEL CD8+ T cell population at several states of differentiation, representing functionally distinct TRM cell subsets as well as a subset of TRM cell precursors within the tissue early in infection. Taken together, these findings may inform strategies to optimize CD8+ T cell responses to protect against microbial infection and cancer.