Cells transmit information through molecular signals that often show complex dynamical patterns. The dynamic behavior of the tumor suppressor p53 varies depending on the stimulus; in response to double-strand DNA breaks, it shows a series of repeated pulses. Using a computational model, we identified a sequence of precisely timed drug additions that alter p53 pulses to instead produce a sustained p53 response. This leads to the expression of a different set of downstream genes and also alters cell fate: Cells that experience p53 pulses recover from DNA damage, whereas cells exposed to sustained p53 signaling frequently undergo senescence. Our results show that protein dynamics can be an important part of a signal, directly influencing cellular fate decisions.

ABSTRACT Complete and robust human genome duplication requires loading MCM helicase complexes at many DNA replication origins, an essential process termed origin licensing. Licensing is restricted to G1 phase of the cell cycle, but G1 length varies widely among cell types. Using quantitative single cell analyses we found that pluripotent stem cells with naturally short G1 phases load MCM much faster than their isogenic differentiated counterparts with long G1 phases. During the earliest stages of differentiation towards all lineages, MCM loading slows concurrently with G1 lengthening, revealing developmental control of MCM loading. In contrast, ectopic Cyclin E overproduction uncouples short G1 from fast MCM loading. Rapid licensing in stem cells is caused by accumulation of the MCM loading protein, Cdt1. Prematurely slowing MCM loading in pluripotent cells not only lengthens G1 but also accelerates differentiation. Thus, rapid origin licensing is an intrinsic characteristic of stem cells that contributes to pluripotency maintenance.

Abstract Background and Aims Single-cell transcriptomics offer unprecedented resolution of tissue function at the cellular level, yet studies analyzing healthy adult human small intestine and colon are sparse. Here, we present single-cell transcriptomics covering the duodenum, jejunum, ileum, and ascending, transverse, and descending colon from 3 humans. Methods 12,590 single epithelial cells from three independently processed organ donors were evaluated for organ-specific lineage biomarkers, differentially regulated genes, receptors, and drug targets. Analyses focused on intrinsic cell properties and capacity for response to extrinsic signals along the gut axis across different humans. Result Cells were assigned to 25 epithelial lineage clusters. Human intestinal stem cells (ISCs) are not specifically marked by many murine ISC markers. Lysozyme expression is not unique to human Paneth cells (PCs), and PCs lack expression of expected niche-factors. BEST4 + cells express NPY and show maturational differences between SI and colon. Tuft cells possess a broad ability to interact with the innate and adaptive immune systems through previously unreported receptors. Some classes of mucins, hormones, cell-junction, and nutrient absorption genes show unappreciated regional expression differences across lineages. Differential expression of receptors and drug targets across lineages reveals biological variation and potential for variegated responses. Conclusions Our study identifies novel lineage marker genes; covers regional differences; shows important differences between mouse and human gut epithelium; and reveals insight into how the epithelium responds to the environment and drugs. This comprehensive cell atlas of the healthy adult human intestinal epithelium resolves likely functional differences across anatomical regions along the gastrointestinal tract and advances our understanding of human intestinal physiology.

Abstract Oncogene-induced replication stress generates endogenous DNA damage that activates cGAS/STING-mediated innate immune signaling and tumor suppression 1-3 . However, the mechanism for cGAS activation by endogenous DNA damage remains enigmatic, particularly given the constitutive inhibition of cGAS by high-affinity histone acidic patch (AP) binding 4-10 . Here we report an in vivo CRISPR screen that identified the DNA double strand break sensor Mre11 as a suppressor of mammary tumorigenesis induced by Myc overexpression and p53 deficiency. Mre11 antagonizes Myc-induced proliferation through cGAS/STING activation. Direct binding of the Mre11-Rad50-Nbn (MRN) complex to nucleosomes displaces cGAS from AP sequestration, which is required for DNA damage-induced cGAS mobilization and activation by cytosolic DNA. Mre11 is thereby essential for cGAS activation in response to oncogenic stress, cytosolic DNA transfection, and ionizing radiation. Furthermore, we show Mre11-dependent cGAS activation suppresses Myc-induced proliferation through ZBP1/RIPK3/MLKL-mediated necroptosis. In human triple-negative breast cancer, ZBP1 downregulation correlates with increased genome instability, decreased immune infiltration, and poor patient prognosis. These findings establish Mre11 as a critical link between DNA damage and cGAS activation that regulates tumorigenesis through ZBP1-dependent necroptosis. One-sentence summary Mre11 is required for cGAS activation during oncogenic stress and promotes ZBP1-dependent necroptosis.

ABSTRACT MCM complexes are loaded onto chromosomes to license DNA replication origins in G1 phase of the cell cycle, but it is not yet known how mammalian MCM complexes are adequately distributed to both euchromatin and heterochromatin. To address this question, we combined time-lapse live-cell imaging with fixed cell immunofluorescence imaging of single human cells to quantify the relative rates of MCM loading in heterochromatin and euchromatin at different times within G1. We report here that MCM loading in euchromatin is faster than in heterochromatin in very early G1, but surprisingly, heterochromatin loading accelerates relative to euchromatin loading in middle and late G1. These different loading dynamics require ORCA-dependent differences in ORC distribution during G1. A consequence of heterochromatin origin licensing dynamics is that cells experiencing a truncated G1 phase from premature cyclin E expression enter S phase with under-licensed heterochromatin, and DNA damage accumulates preferentially in heterochromatin in the subsequent S/G2 phase. Thus G1 length is critical for sufficient MCM loading, particularly in heterochromatin, to ensure complete genome duplication and to maintain genome stability.

ABSTRACT The CDK4/6 inhibitor palbociclib blocks cell cycle progression in ER+/HER2- breast tumor cells. Although these drugs have significantly improved patient outcomes in metastatic breast cancers, a small percentage of tumor cells continues to divide in the presence of palbociclib—a phenomenon we refer to as fractional resistance. It is critical to understand the cellular mechanisms underlying fractional resistance because the precise percentage of resistant cells in patient tissue is a strong predictor of clinical outcome. Here, we hypothesize that fractional resistance arises from cell-to-cell differences in core cell cycle regulators that allow a subset of cells to escape CDK4/6 inhibitor therapy. We used multiplex, single-cell imaging to identify fractionally resistant tumor cells both in a cell culture model of ER+/HER2- breast cancer as well as live primary tumor cells resected from a patient. We found that tumor cells capable of proliferating in the presence of palbociclib showed both expected (e.g., CDK2, E2F1) and unexpected (e.g., Cdt1, p21, cyclin B1) shifts in core cell cycle regulators. Notably, resistant cells in both tumor models showed premature enrichment of the G1 regulators E2F1 and CDK2 protein and, unexpectedly, the G2/M regulator cyclin B1 just before cell cycle entry, suggesting that resistant cells may use noncanonical mechanisms to overcome CDK4/6 inhibition. Using computational data integration and trajectory inference approaches, we show how plasticity in cell cycle regulators gives rise to alternate cell cycle “paths” that allow individual ER+/HER2- tumor cells to escape palbociclib treatment. Understanding drivers of cell cycle plasticity, and how to eliminate resistant cell cycle paths, could lead to improved cancer therapies targeting fractionally resistant cells to improve patient outcomes.

A bstract With the growing number of single-cell datasets collected under more complex experimental conditions, there is an opportunity to leverage single-cell variability to reveal deeper insights into how cells respond to perturbations. Many existing approaches rely on discretizing the data into clusters for differential gene expression (DGE), effectively ironing out any information unveiled by the single-cell variability across cell-types. In addition, DGE often assumes a statistical distribution that, if erroneous, can lead to false positive differentially expressed genes. Here, we present Cellograph: a semi-supervised framework that uses graph neural networks to quantify the effects of perturbations at single-cell granularity. Cellograph not only measures how prototypical cells are of each condition but also learns a latent space that is amenable to interpretable data visualization and clustering. The learned gene weight matrix from training reveals pertinent genes driving the differences between conditions. We demonstrate the utility of our approach on publicly-available datasets including cancer drug therapy, stem cell reprogramming, and organoid differentiation. Cellograph outperforms existing methods for quantifying the effects of experimental perturbations and offers a novel framework to analyze single-cell data using deep learning.

Abstract Current methods for analyzing single-cell datasets have relied primarily on static gene expression measurements to characterize the molecular state of individual cells. However, capturing temporal changes in cell state is crucial for the interpretation of dynamic phenotypes such as the cell cycle, development, or disease progression. RNA velocity infers the direction and speed of transcriptional changes in individual cells, yet it is unclear how these temporal gene expression modalities may be leveraged for predictive modeling of cellular dynamics. Here, we present the first task-oriented benchmarking study that investigates integration of temporal sequencing modalities for dynamic cell state prediction. We benchmark eight integration approaches on eight datasets spanning different biological contexts, sequencing technologies, and species. We find that integrated data more accurately infers biological trajectories and achieves increased performance on classifying cells according to perturbation and disease states. Furthermore, we show that simple concatenation of spliced and unspliced molecules performs consistently well on classification tasks and can be used over more memory intensive and computationally expensive methods. This work provides users with practical recommendations for task-specific integration of single-cell gene expression modalities.

Abstract Cell cycle gene expression programs fuel proliferation and are dysregulated in many cancers. The retinoblastoma-family proteins, RB, p130/RBL2 and p107/RBL1, coordinately repress cell cycle gene expression, inhibiting proliferation and suppressing tumorigenesis. Ubiquitin-dependent protein degradation is essential to cell cycle control, and numerous proliferative regulators, tumor suppressors, and oncoproteins are ubiquitinated. However, little is known about the role of ubiquitin signaling in controlling RB-family proteins. A systems genetics analysis of several hundred CRISPR/Cas9 loss-of-function screens suggested the potential regulation of the RB-network by cyclin F, a substrate recognition receptor for the SCF family of E3 ligases. We demonstrate that RBL2/p130 is a direct substrate of SCF cyclin F . We map a cyclin F regulatory site to a flexible linker in the p130 pocket domain, and show that this site mediates binding, stability, and ubiquitination. Expression of a non-degradable p130 represses cell cycle gene expression and strongly reduces proliferation. These data suggest that SCF cyclin F plays a key role in the CDK-RB network and raises the possibility that aberrant p130 degradation could dysregulate the cell cycle in human cancers.