Abstract Background Medulloblastoma (MB) is a malignant tumour of the cerebellum which can be classified into four major subgroups based on gene expression and genomic features. Single cell transcriptome studies have defined the cellular states underlying each MB subgroup, however the spatial organisation of these diverse cell states and how this impacts response to therapy remains to be determined. Methods Here, we used spatially resolved transcriptomics to define the cellular diversity within a sonic hedgehog (SHH) patient-derived model of MB and identify how cells specific to a transcriptional state or spatial location are pivotal in responses to treatment with the CDK4/6 inhibitor, Palbociclib. We integrated spatial gene expression with histological annotation and single cell gene expression data from MB, developing a analysis strategy to spatially map cell type responses within the hybrid system of human and mouse cells and their interface within an intact brain tumour section. Results We distinguish neoplastic and non-neoplastic cells within tumours and from the surrounding cerebellar tissue, further refining pathological annotation. We identify a regional response to Palbociclib, with reduced proliferation and induced neuronal differentiation in both treated tumours. Additionally, we resolve at a cellular resolution a distinct tumour interface where the tumour contacts neighbouring mouse brain tissue consisting of abundant astrocytes and microglia and continues to proliferate despite Palbociclib treatment. Conclusions Our data highlight the power of using spatial transcriptomics to characterise the response of a tumour to a targeted therapy and provide further insights into the molecular and cellular basis underlying the response and resistance to CDK4/6 inhibitors in SHH MB.

Abstract Cell-cell interaction (CCI) analyses are an indispensable tool for harnessing the detail and depth of spatial and single-cell transcriptomics datasets by inferring inter-cellular communications, but no methods to integrate CCI results across samples exist currently. To address this, we have developed a computational pipeline, Multimodal CCI (MMCCI), to statistically integrate and analyze CCI results from existing popular CCI tools. We benchmarked MMCCI’s integration on single-cell spatial datasets and found it to be highly accurate compared to simpler methods. We utilized MMCCI’s integration and downstream biological analyses to uncover global and differential interaction patterns in multimodal aging brain and melanoma spatial datasets.

Abstract BACKGROUND Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG), the most common subtype of Diffuse Midline Glioma (DMG), is a brainstem high-grade glioma arising in young children and always proves fatal. Major challenges include the disease’s intratumoural genetic and cellular heterogeneity as well as its diffusely invasive phenotype. Research of the last few years has highlighted that interactions between cancer cells, the nervous system and immune cells crucially contribute to tumour cell invasion and disease malignancy. Hence, a better understanding of cancer-promoting interactions is a key requirement to elucidate novel strategies for the treatment of this devastating disease. METHOD We performed spatial transcriptomic sequencing on 10 sequential tumour-infiltrated DIPG patient brainstem regions, using the 10x Genomics Visium platform. RESULTS Spatially-informed analysis and cell type clustering overall highlighted the molecular intratumoural heterogeneity present in the disease. We assessed cell cluster interactions as well as receptor-ligand (RL) pairing, illustrating communication between neuronal, immune cell and tumour clusters. We further determined respective RL pairs involved in such. To address the question whether invasive edges genetically differ from the tumour core, we evaluated genes that are significantly correlated with distal brainstem regions compared to tumour proximal sites. Results revealed gene signatures that are highly associated with neuronal signalling and communication, validating previous findings emphasising the importance of neuron-to-glioma interactions driving DIPG disease progression. CONCLUSION DIPG is a lethal paediatric brainstem glioma for which more durable therapeutic modalities remain to be found. In-depth analysis of this disease is often hampered due to the lack of patient tissue suitable for laboratory studies. Our patient autopsy specimen, spanning the entire tumour-infiltrated brainstem provided a platform to study this aggressive disease in a spatio-temporal manner. This analysis elucidates how DIPG is driven by the tumour microenvironment, including associated receptor-ligand interactions. This has the potential to ultimately discover new treatment targets.

Abstract The SARS-CoV-2 (COVID-19) virus has caused a devastating global pandemic of respiratory illness. To understand viral pathogenesis, methods are available for studying dissociated cells in blood, nasal samples, bronchoalveolar lavage fluid, and similar, but a robust platform for deep tissue characterisation of molecular and cellular responses to virus infection in the lungs is still lacking. We developed an innovative spatial multi-omics platform to investigate COVID-19-infected lung tissues. Five tissue-profiling technologies were combined by a novel computational mapping methodology to comprehensively characterise and compare the transcriptome and targeted proteome of virus infected and uninfected tissues. By integrating spatial transcriptomics data (Visium, GeoMx and RNAScope) and proteomics data (CODEX and PhenoImager HT) at different cellular resolutions across lung tissues, we found strong evidence for macrophage infiltration and defined the broader microenvironment surrounding these cells. By comparing infected and uninfected samples, we found an increase in cytokine signalling and interferon responses at different sites in the lung and showed spatial heterogeneity in the expression level of these pathways. These data demonstrate that integrative spatial multi-omics platforms can be broadly applied to gain a deeper understanding of viral effects on cellular environments at the site of infection and to increase our understanding of the impact of SARS-CoV-2 on the lungs.

ABSTRACT Emerging spatially-resolved sequencing technologies offer unprecedented possibilities to study cellular functionality and organisation, transforming our understanding of health and disease. The necessity to understand healthy and diseased tissues in its entirety becomes even more evident for the human brain, the most complex organ in the body. The brain’s cellular architecture and corresponding functions are tightly regulated. However, when intercellular communications are altered by pathologies, such as brain cancer, these microenvironmental interactions are disrupted. DIPG is a brainstem high-grade glioma arising in young children and is universally fatal. Major disease obstacles include intratumoural genetic and cellular heterogeneity as well as a highly invasive phenotype. Recent breakthrough studies have highlighted the vital oncogenic capacity of brain cancer cells to functionally interact with the central nervous system (CNS). This CNS-crosstalk crucially contributes to tumour cell invasion and disease progression. Ongoing worldwide efforts seek to better understand these cancer-promoting CNS interactions to develop more effective DIPG anti-cancer therapies. In this study, we performed spatial transcriptomic analysis of a complete tumour-infiltrated brainstem from a single DIPG patient. Gene signatures from ten sequential tumour regions were analysed to assess disease progression and to study DIPG cell interactions with the tumour microenvironment (TME). We leveraged this unique DIPG dataset to evaluate genes significantly correlated with invasive tumour distal regions versus the proximal tumour initiation site. Furthermore, we assessed novel ligand-receptor pairs that actively promote DIPG tumour progression via crosstalk with endothelial, neuronal and immune cell communities, which can be utilised to support future research efforts in this area of high unmet need.

Abstract Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain cancer and is associated with very poor prognosis. Standard treatment involves surgical resection, post-operative radiation and TMZ chemotherapy. Further research into new therapeutic approaches which target chemo-resistant tumor propagating cells, are urgently required. The EphA3 receptor is frequently elevated in GBM, particularly in the mesenchymal subtype and expressed on tumor-initiating cells (Day et al. Cancer Cell 2013). Our data in GBM tissue shows that tumor cells expressing the high-affinity EphA3 ligand, ephrin A5; are distinct from EphA3 expressing cells. The ephrin A5-positive cells express the glial differentiation marker GFAP, are less proliferative and less stem cell-like. EphA3 is expressed on the vimentin-positive, highly proliferative cell population. Single cell RNA-sequencing revealed that EphA3 and ephrin A5 are highly expressed in recurrent GBM, and are markers of MES-like and AC-like cell states respectively. Ephrin A5 over-expression in-vivo led to extension of survival in orthotopic xenograft animal models. GBM aggressiveness and downregulation of stem cell markers. Spatial transcriptomics of xenograft tumors revealed a reduction in proliferation markers including Ki67, MCM7 and PCNA. We detected an increase in expression of AC-like cell-state with a concomitant reduction of the MES-like and NPC-like cell-states. Consistently, over-expression of ephrin-A5 in primary GBM lines led to a reduction in neurosphere formation, Ki67 staining and growth rates. Thus we propose that dual targeting of EphA3 and ephrin-A5 might better capture GBM tumour heterogeneity and lead to an extension GBM patient survival. Whilst better understanding the biology of ephrinA5 expression, we also aim to validate antibody-based approaches to perform dual targeting of EphA3 and ephrin A5, leading to an extension GBM patient survival.

Abstract Spatial transcriptomic (ST) data enables us to link tissue morphological features with thousands of unseen gene expression values, opening a horizon for breakthroughs in digital pathology. Models to predict the presence/absence, high/low, or continuous expression of a gene using images as the only input have a huge potential clinical applications, but such models require improvements in accuracy, interpretability, and robustness. We developed STimage models to estimate parameters of gene expression as distributions rather than fixed data points, thereby allowing for the essential quantification of uncertainty in the predicted results. We assessed aleatoric and epistemic uncertainty of the models across a diverse range of test cases and proposed an ensemble approach to improve the model performance and trust. STimage can train prediction models for one gene marker or a panel of markers and provides important interpretability analyses at a single-cell level, and in the histopathological annotation context. Through a comprehensive benchmarking with existing models, we found that STimage is more robust to technical variation in platforms, data types, and sample types. Using images from the cancer genome atlas, we showed that STimage can be applied to non-spatial omics data. STimage also performs better than other models when only a small training dataset is available. Overall, STimage contributes an important methodological advance needed for the potential application of spatial technology in cancer digital pathology.

Abstract Objectives Langerhans cells (LCs) are epithelial antigen‐presenting cells (APC) contributing to immune surveillance. LCs depend on interleukin 34 (IL34) production by epithelial cells. This study aimed to uncover mechanisms of alteration of IL34 and LC function in squamous cell carcinoma (SCC). Methods Cancer cohort data were used to identify associations between SCC and IL34. ATAC‐seq of keratinocytes (KCs) and LCs from a murine model of epithelial hyperplasia, driven by HPV16 E7 oncoprotein (K14E7), was analysed. Transcriptomic data were used to validate findings. RNAscope, RT‐qPCR, ELISA and confocal imaging was used to analyse IL34 expression and LCs in a spatial context. Results IL34 mRNA is downregulated in human SCCs of the head and neck, the cervix, the lung and the oesophagus, and low IL34 expression is associated with poor survival. We demonstrate that KCs of K14E7 mice have reduced Il34 gene accessibility, mRNA and protein, as well as broad changes in promotor accessibility associated with cell adhesion and immune responses. Chromatin accessibility was substantially changed in LCs, including increased accessibility of the Csf1r gene, and changes in promotors associated with cytoskeleton arrangement and antigen processing and presentation. We discovered altered spatial LC dendrite organisation in hyperproliferative epithelium. Conclusion Squamous cell carcinoma of the cervix, head and neck, oesophagus and lung demonstrate downregulation of IL34, which is associated with poor survival, and with alterations in LC spatial organisation and function. These findings suggest that reduced IL34 expression in SCC may contribute to impaired local immunity through LC dysregulation.