Abstract Mammalian haploid somatic cells are unstable and prone to diploidize, but the cause of haploid instability remains largely unknown. Previously, we found that mammalian haploid somatic cells suffer chronic centrosome loss stemming from the uncoupling of DNA replication and centrosome duplication cycles. However, the lack of methodology to restore the coupling between DNA replication and centrosome duplication has precluded us from investigating the potential contribution of the haploidy-linked centrosome loss to haploid instability. In this study, we developed an experimental method that allows the re-coupling of DNA and centrosome cycles through the chronic extension of the G1/S phase without compromising cell proliferation using thymidine treatment/release cycles. Chronic extension of G1/S restored normal mitotic centrosome number and mitotic control, substantially improving the stability of the haploid state in HAP1 cells. Stabilization of the haploid state was compromised when cdk2 was inhibited during the extended G1/S, or when early G1 was chronically extended instead of G1/S, showing that the coupling of DNA and centrosome cycles rather than a general extension of the cell cycle is required for haploid stability. Our data indicate the chronic centriole loss arising from the uncoupling of centrosome and DNA cycles as a direct cause of genome instability in haploid somatic cells, and also demonstrate the feasibility of modulation of haploid stability through artificial coordination between DNA and centrosome cycles in mammalian somatic cells.

Abstract Tetraploidy caused by whole-genome duplication is a hallmark of cancer cells, and tetraploidy-selective cell growth suppression is a potential strategy for targeted cancer therapy. However, how tetraploid cells differ from normal diploids in their sensitivity to anti-proliferative treatments remains largely unknown. In this study, we found that tetraploid cells are significantly more susceptible to inhibitors of a mitotic kinesin CENP-E than diploids. CENP-E inhibitor preferentially diminished the tetraploid cell population in diploid-tetraploid co-culture at optimum conditions. Live imaging revealed that tetraploidy-linked increase in unsolvable polar chromosome misalignment caused substantially longer mitotic delay in tetraploids than in diploids upon moderate CENP-E inhibition. This time gap of mitotic arrest resulted in cohesion fatigue and subsequent cell death, specifically in tetraploids, leading to tetraploidy-selective cell growth suppression. In contrast, the microtubule-stabilizing compound paclitaxel caused tetraploidy-selective growth suppression through the aggravation of spindle multipolarization. We also found that CENP-E inhibitor had superior generality to paclitaxel in its tetraploidy selectivity across a broader spectrum of cell lines. Our results highlight the unique properties of CENP-E inhibitors in tetraploidy-selective suppression, giving us clues on the further development of tetraploidy-targeting interventions in cancer.

During mitotic spindle assembly, microtubules generate tensile stresses on pericentriolar material (PCM), the outermost layer of centrosomes. The molecular interactions that enable PCM to assemble rapidly and resist external forces are unknown. Here we use cross-linking mass spectrometry to identify interactions underlying supramolecular assembly of SPD-5, the main PCM scaffold protein in C. elegans . Crosslinks map primarily to alpha helices within the phospho-regulated region (PReM), a long C-terminal coiled-coil, and a series of four N-terminal coiled-coils. PLK-1 phosphorylation of SPD-5 creates new homotypic contacts, including two between PReM and the CM2-like domain, and eliminates numerous contacts in disordered linker regions, thus favoring coiled-coil-specific interactions. Mutations within these interacting regions cause PCM assembly defects that are partly rescued by eliminating microtubule-mediated forces. Thus, PCM assembly and strength are interdependent. In vitro , self-assembly of SPD-5 scales with coiled-coil content, although there is a defined hierarchy of association. We propose that multivalent interactions among coiled-coil regions of SPD-5 build the PCM scaffold and contribute sufficient strength to resist microtubule-mediated forces.

Abstract Haploid embryonic lethality is a common feature in vertebrates. However, the developmental defects and timing of lethality in haploid embryos differ between non-mammalian and mammalian species. Therefore, it remains unknown whether vertebrates share common principles of haploid intolerance. We investigated haploidy-linked defects at the cellular level in gynogenetic haploid zebrafish larvae that manifest characteristic morphogenetic abnormalities. Haploid larvae suffered severe mitotic arrest and irregular upregulation of p53, leading to unscheduled cell death. Either mitigation of mitotic arrest by spindle assembly checkpoint inactivation or depletion of p53 significantly improved organ growth in haploid larvae, indicating the critical contribution of these cellular defects to haploidy-linked morphogenetic defects. Moreover, haploid zebrafish larvae suffered frequent centrosome loss resulting in mitotic spindle monopolarization, a leading cause of mitotic instability in haploid mammalian cells (1, 2). Haploid larvae also suffered ciliopathy associated with severe centrosome loss. Based on our results, we propose the ploidy-linked alteration in centrosome number control as a common principle constraining the allowable ploidy state for normal development in vertebrates. Significance statement Haploid embryos possessing a single chromosome set are invariably lethal in vertebrates. Though haploid intolerance is attributed to imprinting misregulation in mammals, it remains unknown what limits the developmental capacity of haploid non-mammalian vertebrates free from the imprinting constraint. This study revealed the haploidy-linked mitotic misregulation and p53 upregulation as the leading cause of organ growth retardation in haploid zebrafish larvae. Accompanied by these defects, haploid larvae manifested drastic centrosome loss and mitotic spindle monopolarization, defects also limiting the proliferative capacity of haploid mammalian cells. These findings suggest the ploidy-linked alteration in centrosome number control as a common cell-intrinsic principle of haploid intolerance in vertebrates, providing an insight into an evolutionary constraint on allowable ploidy status in animal life cycles.

Abstract The somatic haploidy is unstable in diplontic animals, but cellular processes determining haploid stability remain elusive. Here, we found that inhibition of mevalonate pathway by pitavastatin, a widely used cholesterol-lowering drug, drastically destabilized the haploid state in HAP1 cells. Interestingly, cholesterol supplementation did not restore haploid stability in pitavastatin-treated cells, and cholesterol inhibitor U18666A did not phenocopy haploid destabilization. These results ruled out the involvement of cholesterol in haploid stability. Besides cholesterol perturbation, pitavastatin induced endoplasmic reticulum (ER) stress, the suppression of which by a chemical chaperon significantly restored haploid stability in pitavastatin-treated cells. Our data demonstrate the involvement of the mevalonate pathway in the stability of the haploid state in human somatic cells through managing ER stress, highlighting a novel link between ploidy and ER homeostatic control.

Abstract Mammalian somatic cells are generally unstable in the haploid state, resulting in haploid-to-diploid conversion within a short time frame. However, cellular and molecular principles that limit the sustainability of somatic haploidy remain unknown. In this study, we found the haploidy-linked vulnerability to ER stress as a critical cause of haploid intolerance in human somatic cells. Pharmacological induction of ER stress selectively induced apoptosis in haploid cells, facilitating the replacement of haploids by co-existing diploidized cells in a caspase-dependent manner. Biochemical analyses revealed that unfolded protein response (UPR) was activated with similar dynamics between haploids and diploids upon ER stress induction. However, haploids were less efficient in solving proteotoxic status, resulting in a bias toward a proapoptotic mode of UPR signaling. Artificial replenishment of chaperone function or inhibition of a UPR signal transducer ATF6 substantially alleviated the haploidy-linked upregulation of proapoptotic signaling and improved haploid cell retention under ER stress. These data demonstrate that the ER stress-driven haploid instability stems from inefficient proteostatic control that alters the functionality of UPR to cause apoptosis selectively in haploids. Interestingly, haploids suffered a higher level of protein aggregation even in unperturbed conditions, and the long-term stability of the haploid state was significantly improved by alleviating their natural proteotoxicity. Based on these results, we propose that the haploidy-specific vulnerability to ER stress creates a fundamental cause of haploid intolerance in mammalian somatic cells. Our findings provide new insight into the principle that places a stringent restriction on the evolution of animal life cycles.

Abstract In animals, somatic cells are usually diploid and are unstable when haploid for unknown reasons. In this study, by comparing isogenic human cell lines with different ploidies, we found frequent centrosome loss specifically in the haploid state, which profoundly contributed to haploid instability through monopolar spindle formation and subsequent mitotic defects. We also found that efficiency of centriole licensing and duplication, but not that of DNA replication, changes proportionally to ploidy level, causing gradual loss or frequent overduplication of centrioles in haploid and tetraploid cells, respectively. Centriole licensing efficiency seemed to be modulated by astral microtubules, whose development scaled with ploidy level, and artificial enhancement of aster formation in haploid cells restored centriole licensing efficiency to diploid levels. Haploid-specific centrosome loss was also observed in parthenogenetic mouse embryos. We propose that incompatibility between the centrosome duplication and DNA replication cycles arising from different scaling properties of these bioprocesses upon ploidy changes, underlies the instability of non-diploid somatic cells in mammals. Summary Yaguchi et al. show that a delay or acceleration of centriole licensing compromises the control of centrosome number in haploid or tetraploid human cells, respectively, suggesting a cellular basis of the instability of non-diploid somatic cells in mammals.