A challenge in the treatment of Staphylococcus aureus infections is the high prevalence of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains and the formation of non-growing, dormant 'persister' subpopulations that exhibit high levels of tolerance to antibiotics and have a role in chronic or recurrent infections. As conventional antibiotics are not effective in the treatment of infections caused by such bacteria, novel antibacterial therapeutics are urgently required. Here we used a Caenorhabditis elegans-MRSA infection screen to identify two synthetic retinoids, CD437 and CD1530, which kill both growing and persister MRSA cells by disrupting lipid bilayers. CD437 and CD1530 exhibit high killing rates, synergism with gentamicin, and a low probability of resistance selection. All-atom molecular dynamics simulations demonstrated that the ability of retinoids to penetrate and embed in lipid bilayers correlates with their bactericidal ability. An analogue of CD437 was found to retain anti-persister activity and show an improved cytotoxicity profile. Both CD437 and this analogue, alone or in combination with gentamicin, exhibit considerable efficacy in a mouse model of chronic MRSA infection. With further development and optimization, synthetic retinoids have the potential to become a new class of antimicrobials for the treatment of Gram-positive bacterial infections that are currently difficult to cure.

Abstract Among consecutive patients with multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa bacteremia or pneumonia we found those treated with ceftazidime-avibactam were more likely to develop resistance (defined as ≥4-fold increased MIC) than those treated with ceftolozane-tazobactam (40% vs 10%; P = .002). Ceftazidime-avibactam resistance was associated with new mutations in ampC and efflux regulatory pathways.

carbapenemase-producing

Abstract Insertion sequences (IS) are simple transposons implicated in the genome evolution of diverse pathogenic bacterial species. Enterococci have emerged as important human intestinal pathogens with newly adapted virulence potential and antibiotic resistance. These genetic features arose in tandem with large-scale genome evolution mediated by mobile elements. Pathoadaptation in enterococci is thought to be mediated in part by the IS element IS256 through gene inactivation and recombination events. However, the regulation of IS256 and the mechanisms controlling its activation are not well understood. Here, we adapt an IS256-specfic deep sequencing method to describe how chronic lytic phage infection drives widespread diversification of IS256 in E. faecalis and how antibiotic exposure is associated with IS256 diversification in both E. faecalis and E. faecium during a clinical human infection. We show through comparative genomics that IS256 is primarily found in hospital-adapted enterococcal isolates. Analyses of IS256 transposase gene levels reveal that IS256 mobility is regulated at the transcriptional level by multiple mechanisms in E. faecalis , indicating tight control of IS256 activation in the absence of selective pressure. Our findings reveal that stressors such as phages and antibiotic exposure drives rapid genome-scale transposition in the enterococci. IS256 diversification can therefore explain how selective pressures mediate evolution of the enterococcal genome, ultimately leading to the emergence of dominant nosocomial lineages that threaten human health. Author Summary Insertion sequence (IS) elements are simple transposons that are ubiquitous in bacteria. In the enterococci, which includes medically relevant species such as Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium , the IS element IS256 is widespread and has been implicated in pathogenesis and antibiotic resistance. Despite the importance of IS256 to the biology of the enterococci, we know very about how this element is regulated and diversifies enterococcal genomes. Here, we show that IS256 is preferentially found in hospital-adapted and virulent strains of the enterococci. In E. faecalis V583, a vancomycin resistant blood isolate, IS256 is regulated by multiple transcriptional mechanisms. To understand how IS256 is mobilized, we adapted an Illumina-based deep sequencing method called IS-Seq to find novel IS256 insertions when applying the selective pressure of bacteriophage (phage) predation. Using this method, we found that chronic phage infection drives IS256 diversification of the E. faecalis V583 genome. Additionally, we tracked IS256 insertional activity during a human E. faecium infection and found that increased IS256 diversity was associated with specific antibiotic usage. Together, our results demonstrate that the enterococci control IS256 activity to diversify their genomes which may lead to the emergence of hospital-adapted strains that threaten human health.

Abstract Burkholderia spp. are often resistant to antibiotics, and infections with these organisms are difficult to treat. A potential alternative treatment for Burkholderia spp. infections is bacteriophage (phage) therapy; however, it can be difficult to locate phages that target these bacteria. Prophages incorporated into the bacterial genome have been identified within Burkholderia spp. and may represent a source of useful phages for therapy. Here we investigate whether prophages within Burkholderia spp. clinical isolates can kill conspecific and heterospecific isolates. Thirty-two Burkholderia spp. isolates were induced for prophage release, and harvested prophages were tested for lytic activity against the same 32 isolates. Lytic phages were passaged and their host ranges were determined, resulting in four unique phages of prophage origin that showed different ranges of lytic activity. We also analyzed the prophage content of 35 Burkholderia spp. clinical isolate genomes, and identified several prophages present in the genomes of multiple isolates of the same species. Finally, we observed that B. cenocepacia isolates were more phage-susceptible than Burkholderia multivorans isolates. Overall, our findings suggest that prophages present within Burkholderia spp. genomes are a potentially useful starting point for the isolation and development of novel phages for use in phage therapy.

Abstract Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CR Ab ) are a major cause of healthcare-associated infections. CR Ab are typically multidrug-resistant and infection is difficult to treat. Despite the urgent threat that CR Ab pose, few systematic studies of CR Ab clinical and molecular epidemiology have been conducted. The Study Network of Acinetobacter as a Carbapenem-Resistant Pathogen (SNAP) is designed to investigate the clinical characteristics and contemporary population structure of CR Ab circulating in US hospital systems using whole genome sequencing (WGS). Analysis of the initial 120 SNAP patients from four US centers revealed that CR Ab remain a significant threat to hospitalized patients, affecting the most vulnerable patients and resulting in 24% all-cause 30-day mortality. The majority of currently circulating isolates belonged to ST2 Pas , a part of Clonal Complex 2 (CC2), which is the dominant drug-resistant lineage in the United States and Europe. We identified three distinct sub-lineages within CC2, which differed in their antibiotic resistance phenotypes and geographic distribution. Most concerning, colistin resistance (38%) and cefiderocol (10%) resistance were common within CC2 sub-lineage C (CC2C), where the majority of isolates belonged to ST2 Pas /ST281 Ox . Additionally, we identified a newly emergent lineage, ST499 Pas that was the most common non-CC2 lineage in our study and had a more favorable drug susceptibility profile compared to CC2. Our findings suggest a shift within the CR Ab population in the US during the past 10 years, and emphasize the importance of real-time surveillance and molecular epidemiology in studying CR Ab dissemination and clinical impact. Importance Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CR Ab ) constitute a major threat to public health. To elucidate the molecular and clinical epidemiology of CR Ab in the US, clinical CR Ab isolates were collected along with data on patient characteristics and outcomes and bacterial isolates underwent whole genome sequencing and antibiotic susceptibility phenotyping. Key findings included emergence of new sub-lineages within the globally predominant clonal complex (CC) 2, increased colistin and cefiderocol resistance within one of the CC2 sub-lineages, and the emergence of ST499 Pas as a previously unrecognized CR Ab lineage in US hospitals.

Antagonistic behaviors between bacterial cells can have profound effects on microbial populations and disease outcomes. Polymicrobial interactions may be mediated by contact-dependent proteins with antibacterial properties. The Type VI Secretion System (T6SS) is a macromolecular weapon used by Gram-negative bacteria to translocate proteins into adjacent cells. The T6SS is used by pathogens to escape immune cells, eliminate commensal bacteria, and facilitate infection. Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-negative opportunistic pathogen that causes a wide range of infections in immunocompromised patients and infects the lungs of patients with cystic fibrosis. Infections with the bacterium can be deadly and are challenging to treat because many isolates are multidrug-resistant. We found that globally dispersed S. maltophilia clinical and environmental strains possess T6SS genes. We demonstrate that the T6SS of an S. maltophilia patient isolate is active and can eliminate other bacteria. Furthermore, we provide evidence that the T6SS contributes to the competitive fitness of S. maltophilia against a co-infecting Pseudomonas aeruginosa isolate, and that the T6SS alters the cellular organization of S. maltophilia and P. aeruginosa co-cultures. This study expands our knowledge of the mechanisms employed by S. maltophilia to secrete antibacterial proteins and compete against other bacteria.Infections with the opportunistic pathogen Stenotrophomonas maltophilia can be fatal for immunocompromised patients. The mechanisms used by the bacterium to compete against other prokaryotes are not well understood. We found that the T6SS allows S. maltophilia to eliminate other bacteria and contributes to the competitive fitness against a co-infecting isolate. The presence of T6SS genes in isolates across the globe highlights the importance of this apparatus as a weapon in the antibacterial arsenal of S. maltophilia . The T6SS may confer survival advantages to S. maltophilia isolates in polymicrobial communities in both environmental settings and during infections.

Carbapenem-non-susceptible Citrobacter spp. (CNSC) are increasingly recognized as healthcare-associated pathogens. Information regarding their clinical epidemiology, genetic diversity, and mechanisms of carbapenem resistance is lacking. We examined microbiology records of adult patients at the University of Pittsburgh Medical Center (UMPC) Presbyterian Hospital (PUH) from 2000-2018 for CNSC, as defined by ertapenem non-susceptibility. Over this timeframe, the proportion of CNSC increased from 4% to 10% (P=0.03), as did carbapenem daily defined doses/1000 patient days (6.52 to 34.5, R2=0.831, P<0.001), which correlated with the observed increase in CNSC (lag=0 years, R2=0.660). Twenty CNSC isolates from 19 patients at PUH and other UPMC hospitals were available for further analysis, including whole-genome short-read sequencing and additional antimicrobial susceptibility testing. Of the 19 patients, nearly all acquired CNSC in the healthcare setting and over half had polymicrobial cultures containing at least one other organism. Among the 20 CNSC isolates, C. freundii was the predominant species identified (60%). CNSC genomes were compared with genomes of carbapenem-susceptible Citrobacter spp. from UPMC, and with other publicly available CNSC genomes. Isolates encoding carbapenemases (blaKPC-2, blaKPC-3, and blaNDM-1) were also long-read sequenced, and their carbapenemase-encoding plasmid sequences were compared with one another and with publicly available sequences. Phylogenetic analysis of 102 UPMC Citrobacter spp. genomes showed that CNSC from our setting did not cluster together. Similarly, a global phylogeny of 64 CNSC genomes showed a diverse population structure. Our findings suggest that both local and global CNSC populations are genetically diverse, and that CNSC harbor carbapenemase-encoding plasmids found in other Enterobacterales.

ABSTRACT Enterococcus faecalis are hospital-associated opportunistic pathogens and also causative agents of post-operative endophthalmitis. Patients with enterococcal endophthalmitis often have poor visual outcomes, despite appropriate antibiotic therapy. Here we investigated the genomic and phenotypic characteristics of E. faecalis isolates collected from 13 patients treated at the University of Pittsburgh Medical Center Eye Center over 19 years. Comparative genomic analysis indicated that patients were infected with E. faecalis of diverse multi-locus sequence types (STs) previously associated with clinical, commensal, and environmental sources. We identified known E. faecalis virulence factors and antibiotic resistance genes in each genome, including genes conferring resistance to aminoglycosides, erythromycin, and tetracyclines. We assessed all isolates for their cytolysin production, biofilm formation, and antibiotic susceptibility, and observed phenotypic differences between isolates. Fluoroquinolone and cephalosporin susceptibilities were particularly variable, as were biofilm formation and cytolysin production. In addition, we found evidence of E. faecalis adaptation during recurrent endophthalmitis by identifying genetic variants that arose in sequential isolates sampled over eight-months from the same patient. We identified a mutation in the DNA mismatch repair gene mutS that was associated with a hypermutator phenotype in the final isolate from the patient, which was also more resistant to ceftazidime. Overall this study documents the genomic and phenotypic variability among E. faecalis causing endophthalmitis, as well as possible adaptive mechanisms underlying bacterial persistence during recurrent ocular infection. IMPORTANCE Bacterial endophthalmitis is a sight-threatening infection of the inside of the eye. Enterococcus faecalis cause endophthalmitis occasionally, but when they do the infections are often severe. Here we investigated the genomes, antibiotic susceptibilities, and virulence-associated traits among E. faecalis collected from 13 patients with post-operative endophthalmitis. We wondered whether there were common bacterial factors that might explain why enterococcal endophthalmitis is so destructive to ocular tissues. Instead we found that E. feacalis isolated from endophthalmitis were genetically and phenotypically diverse; isolates belonged to a variety of genetic lineages and showed varying levels of antibiotic resistance and biofilm formation. We also undertook further characterization of three closely related E. faecalis isolates from a patient with recurrent endophthalmitis, and found that a hypermutator strain emerged during persistent infection. Hypermutators have been found in a variety of other infection contexts; here we describe what we believe is the first case of a hypermutator arising during ocular infection.

Abstract Enterococcus faecalis is a leading cause of infective endocarditis (IE), especially among older patients with comorbidities. Here we investigated the genomic diversity and antimicrobial susceptibility of 33 contemporary E. faecalis isolates from definite or probable IE cases at the University of Pittsburgh Medical Center (UPMC) between 2018 and 2020. Isolates belonging to two multi-locus sequence types (STs), ST6 and ST179, were isolated from nearly 40% of IE patients. Both of these dominant STs carried known beta-lactam resistance-associated mutations affecting the low-affinity penicillin-binding protein 4 (PBP4). We assessed the ability of ampicillin and ceftriaxone (AC) both alone and in combination to inhibit genetically diverse E. faecalis IE isolates in checkerboard synergy assays and an in vitro one-compartment pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model of AC treatment. ST6 isolates as well as an isolate with a mutation in the PP2C-type protein phosphatase IreP had higher ceftriaxone MICs compared to other isolates, and showed diminished in vitro synergy of AC. Additionally, both ST6 and ST179 isolates exhibited regrowth after 48 hours of humanized exposures to AC. Overall, we found evidence for diminished in vitro AC activity among E. faecalis IE isolates with PBP4 and IreP mutations. This study highlights the need to evaluate alternate antibiotic combinations in clinical practice against diverse contemporary E. faecalis IE isolates.