The appearance of bipotential oval cells in chronic liver injury suggests the existence of hepatocyte progenitor/stem cells. To study the origin and properties of this cell population, oval cell proliferation was induced in adult mouse liver by 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) and a method for their isolation was developed. Transplantation into fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) deficient mice was used to determine their capacity for liver repopulation. In competitive repopulation experiments, hepatic oval cells were at least as efficient as mature hepatocytes in repopulating the liver. In mice with chimeric livers, the oval cells were not derived from hepatocytes but from liver nonparenchymal cells. This finding supports a model in which intrahepatic progenitors differentiate into hepatocytes irreversibly. To determine whether oval cells originated from stem cells residing in the bone marrow, bone marrow transplanted wild-type mice were treated with DDC for 8 months and oval cells were then serially transferred into Fah mutants. The liver repopulating cells in these secondary transplant recipients lacked the genetic markers of the original bone marrow donor. We conclude that hepatic oval cells do not originate in bone marrow but in the liver itself, and that they have valuable properties for therapeutic liver repopulation.

DksA2 and DksA2 bind by X‐ray crystallography (View interaction)

Abstract Mechanistic understanding of the structural basis for DNA recombination in the Cre- loxP system has largely been guided by crystallographic structures of tetrameric synaptic complexes (intasomes). These structural and biochemical studies have suggested that conformational changes and DNA bending in presynaptic complexes underlie site-selection and activation mechanisms of Cre recombinase. Here we used protein engineering and various DNA substrates to isolate the Cre- loxP (54 kDa), Cre2- loxP (110 kDa), and Cre4- loxP 2 assembly intermediates, and determined their structures using cryo-EM to resolutions of 3.9 Å, 4.5 Å, and 3.2 Å, respectively. Progressive DNA bending along the assembly pathway enables formation of increasingly intimate protein-protein interfaces. Insufficient stabilization of important protein motifs observed during the assembly process provides a compelling explanation for the observed half-the-sites activity, and preferential bottom strand cleavage of loxP sequences. We found that selection of loxP sites is largely dependent on Cre’s ability to bend and stabilize the spacer region between two recombinase binding elements. Application of 3D variability analysis to the tetramer data reveals a propensity for motion along the pathway between protomer activation and Holliday junction isomerization. These findings help us to better understand loxP site specificity, controlled activation of alternating protomers, the basis for the observed bias of strand cleavage order, and the importance of conformational sampling, especially with regards to site-selection and activity among Cre variants. Furthermore, our findings provide invaluable information for the rational development of designer, site-specific recombinases for use as gene editing technologies. Highlights Cryo-EM structures of Cre- loxP assembly intermediates (monomer, dimer, and tetramer) provide insights into mechanisms of site recognition, half-the-sites activity, strand cleavage order, and concerted strand cleavage Selectivity of loxP sites arises from few base-specific contacts made by each protomer and is mainly driven by formation of phosphate contacts and DNA deformations that are maximal in the fully assembled “active” tetramer Cis and trans interactions of the β2-3 loop (i) define which sites are “active” and (ii) ensure half-the-sites activity Protein flexibility plays a central role in enabling DNA sequence scanning, recruitment of a second protein to form a dimer, synapsis, control of activity, as well as subsequent recombination steps Conformational sampling within the tetrameric complex was uncovered using 3D variability analysis and revealed the importance of protein-protein interfaces for site- selection and activation of Cre- loxP complexes

Abstract Homo-oligomeric ligand-activated proteins are ubiquitous in biology. The functions of such molecules are commonly regulated by allosteric coupling between ligand binding sites. Understanding the basis for this regulation requires both quantifying the free energy ΔG transduced between sites, and the structural basis by which it is transduced. We consider allostery in three variants of the model ring-shaped homo-oligomeric t rp R NA binding a ttenuation p rotein, TRAP. First, we developed nearest-neighbor statistical thermodynamic binding models comprising microscopic free energies for ligand binding to isolated sites ΔG N0 , and for coupling between one or both adjacent sites, ΔG N1 and ΔG N2 . Using the resulting partition function (PF) we explored the effects of these parameters on simulated population distributions for the 2 N possible liganded states. We then experimentally monitored liganddependent population shifts using conventional spectroscopic and calorimetric methods, and using native mass spectrometry (MS). By resolving species with differing numbers of bound ligands by their mass, native MS revealed striking differences in their ligand-dependent population shifts. Fitting the populations to a binding polynomial derived from the PF yielded coupling free energy terms corresponding to orders of magnitude differences in cooperativity. Uniquely, this approach predicts which of the possible 2 N liganded states are populated at different ligand concentrations, providing necessary insights into regulation. The combination of statistical thermodynamic modeling with native MS may provide the thermodynamic foundation for a meaningful understanding of the structure-thermodynamic linkage that drives cooperativity. TOC Figure (draft) TOC Figure. Ligand (Trp) binding to multiple sites on homo-oligomeric ring-shaped proteins like TRAP alters their functional states. Homotropic cooperativity is expected to alter the activation pathway in response to cellular ligand concentration. In the presence of positive nearest-neighbor cooperativity, ligand binding is favored at adjacent sites, whereas in the absence of cooperativity, a random “Normal” distribution is expected.

ABSTRACT Mechanistic understanding of DNA recombination in the Cre -loxP system has largely been guided by crystallographic structures of tetrameric synaptic complexes. Those studies have suggested a role for protein conformational dynamics that has not been well characterized at the atomic level. We used solution NMR to discover the link between intrinsic flexibility and function in Cre recombinase. TROSY-NMR spectra show the N-terminal and C-terminal catalytic domains (Cre NTD , Cre Cat ) to be structurally independent. Amide 15 N relaxation measurements of the Cre Cat domain reveal fast time scale dynamics in most regions that exhibit conformational differences in active and inactive Cre protomers in crystallographic tetramers. However, the C-terminal helix αN, implicated in assembly of synaptic complexes and regulation of DNA cleavage activity via trans protein-protein interactions, is unexpectedly rigid in free Cre. Chemical shift perturbations and intra- and inter-molecular paramagnetic relaxation enhancement (PRE) NMR data reveal an alternative auto-inhibitory conformation for the αN region of free Cre, wherein it packs in cis over the protein DNA binding surface and active site. Moreover, binding to loxP DNA induces a conformational change that dislodge the C-terminus, resulting in a cis to trans switch that is likely to enable protein-protein interactions required for assembly of recombinogenic Cre intasomes. These findings necessitate a re-examination of the mechanisms by which this widely-utilized gene editing tool selects target sites, avoids spurious DNA cleavage activity, and controls DNA recombination efficiency. SIGNIFICANCE STATEMENT The Cre- loxP system is a widely used gene editing tool that has enabled transformative advances in immunology, neuroscience and cardiovascular research. Still, off-target activities confound research results and present obstacles to biomedical applications. Overcoming those limitations requires understanding the steps leading to assembly of recombination complexes, intasomes . We measured the magnetic properties of nitrogen nuclei in the backbone of the enzyme to correlate its intrinsic dynamics with its function in DNA recognition and cleavage. Remarkably, we found that in the absence of DNA the C-terminus of Cre appears to block the DNA binding surface and active site of the enzyme. Binding to loxP DNA induces a conformational switch that would enable the intermolecular protein-protein interactions required for assembly of recombinogenic Cre intasomes.

Abstract Cre recombinase catalyzes site-specific DNA recombination at pseudo-palindromic loxP sites through two rounds of strand cleavage, exchange, and religation. Cre is a potential gene editing tool of interest due its lack of requirements for external energy sources or host factors, as well as the fact that it does not generate potentially cytotoxic double-stranded DNA breaks. However, broader applications of Cre in editing noncanonical target sequences requires a deeper understanding of the DNA features that enable target site selection and efficient recombination. Although Cre recombines loxP DNA in a specific and ordered fashion, it makes few direct contacts to the loxP spacer, the region where recombination occurs. Furthermore, little is known about the structural and dynamic features of the loxP spacer that make it a suitable target for Cre. To enable NMR spectroscopic studies of the spacer, we have aimed to identify a fragment of the 34-bp loxP site that retains the structural features of the spacer while minimizing the spectral crowding and line-broadening seen in longer oligonucleotides. We report sequential backbone resonance assignments for loxP oligonucleotides of varying lengths and evaluate chemical shift differences, Δδ, between the oligos. Analysis of flanking sequence effects and mutations on spacer chemical shifts indicates that nearest-neighbor and next-nearest-neighbor effects dominate the chemical environment experienced by the spacer. We have identified a 16-bp oligonucleotide that adequately preserves the structural environment of the spacer, setting the stage for NMR-based structure determination and dynamics investigations.

Cellular production of tryptophan is metabolically expensive and tightly regulated. The small Bacillus subtilis zinc binding Anti-TRAP protein (AT), which is the product of the yczA/rtpA gene, is upregulated in response to accumulating levels of uncharged tRNATrp through a T-box antitermination mechanism. AT binds to the undecameric axially symmetric ring-shaped protein TRAP (trp RNA Binding Attenuation Protein), thereby preventing it from binding to the trp leader RNA. This reverses the inhibitory effect of TRAP on transcription and translation of the trp operon. AT principally adopts two symmetric oligomeric states, a trimer (AT3) featuring three-fold axial symmetry or a dodecamer (AT12) comprising a tetrahedral assembly of trimers, whereas only the trimeric form binds and inhibits TRAP. We apply native mass spectrometry (nMS) and small-angle x-ray scattering (SAXS), together with analytical ultracentrifugation (AUC) to monitor the pH and concentration-dependent equilibrium between the trimeric and dodecameric structural forms of AT. In addition, we use solution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to determine the solution structure of AT3, while heteronuclear 15N relaxation measurements on both oligomeric forms of AT provide insights into the dynamic properties of binding-active AT3 and binding-inactive AT12, with implications for TRAP binding and inhibition.

Abstract Cellular production of tryptophan is metabolically expensive and tightly regulated. The small Bacillus subtilis zinc binding Anti-TRAP protein (AT), which is the product of the yczA/rtpA gene, is upregulated in response to accumulating levels of uncharged tRNA Trp through a T-box antitermination mechanism. AT binds to the undecameric ring-shaped protein TRAP ( trp RNA Binding Attenuation Protein), thereby preventing it from binding to the trp leader RNA. This reverses the inhibitory effect of TRAP on transcription and translation of the trp operon. AT principally adopts two symmetric oligomeric states, a trimer (AT 3 ) featuring a three-helix bundle, or a dodecamer (AT 12 ) comprising a tetrahedral assembly of trimers, whereas only the trimeric form has been shown to bind and inhibit TRAP. We demonstrate the utility of native mass spectrometry (nMS) and small-angle x-ray scattering (SAXS), together with analytical ultracentrifugation (AUC) for monitoring the pH and concentration-dependent equilibrium between the trimeric and dodecameric structural forms of AT. In addition, we report the use of solution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to determine the solution structure of AT 3 , while heteronuclear 15 N relaxation measurements on both oligomeric forms of AT provide insights into the dynamic properties of binding-active AT 3 and binding-inactive AT 12 , with implications for TRAP inhibition.