Abstract Nodulin-26 intrinsic proteins (NIPs) are plant-specific multifunctional aquaporin-like channels that are phylogenetically and structurally segregated into three subfamilies: NIP I, II, and III. Each subfamily has a characteristic selectivity filter sequence (the “aromatic-arginine” region, or ar/R) that controls substrate transport specificity based on steric constraints, hydrophobicity, and the spatial orientation of hydrogen bonding moieties. All three NIP subfamilies transport metalloid hydroxides, both beneficial as well as toxic, but with different selectivities. Here we investigated the B, As, and water selectivity of representative Arabidopsis thaliana NIP I and II proteins as well as their ar/R mutants in transport assays as well as through B complementation analysis in the B sensitive nip5;1 mutant background. All NIP proteins, and their ar/R mutants, showed equal permeability to arsenite, but showed differences in boric acid and aquaporin activities that was linked to the amino acid at the helix 2 (H2) position of the ar/R filter (Ala for NIP II and Trp for NIP I). The presence of an alanine at this position in NIP II proteins enhances boric acid permeability and drastically reduces the aquaporin/water permeability of the channel. A NIP II structural model generated from the AlphaFold2 resource and evaluated by MD simulation shows that the alanine results in a wider ar/R pore that accommodates the trigonal boric acid molecule and may allow gating of the pore in a manner that affects water permeability. In contrast, NIP I proteins adopt a more classical aquaporin/glyceroporin arrangement in the ar/R that allows metalloid permeability, although with greater selectivity, as well as permeation by water.

ABSTRACT We developed the Maize PeptideAtlas resource ( www.peptideatlas.org/builds/maize ) to help solve questions about the maize proteome. Publicly available raw tandem mass spectrometry (MS/MS) data for maize were collected from ProteomeXchange and reanalyzed through a uniform processing and metadata annotation pipeline. These data are from a wide range of genetic backgrounds, including the inbred lines B73 and W22, many hybrids and their respective parents. Samples were collected from field trials, controlled environmental conditions, a range of (a)biotic conditions and different tissues, cell types and subcellular fractions. The protein search space included different maize genome annotations for the B73 inbred line from MaizeGDB, UniProtKB, NCBI RefSeq and for the W22 inbred line. 445 million MS/MS spectra were searched, of which 120 million were matched to 0.37 million distinct peptides. Peptides were matched to 66.2% of the proteins (one isoform per protein coding gene) in the most recent B73 nuclear genome annotation (v5). Furthermore, most conserved plastid- and mitochondrial-encoded proteins (NCBI RefSeq annotations) were identified. Peptides and proteins identified in the other searched B73 genome annotations will aid to improve maize genome annotation. We also illustrate high confidence detection of unique W22 proteins. N-terminal acetylation, phosphorylation, ubiquitination, and three lysine acylations (K-acetyl, K-malonyl, K-hydroxyisobutyryl) were identified and can be inspected through a PTM viewer in PeptideAtlas. All matched MS/MS-derived peptide data are linked to spectral, technical and biological metadata. This new PeptideAtlas is integrated with community resources including MaizeGDB at https://www.maizegdb.org/ and a peptide track in JBrowse.

ABSTRACT This study describes a new release of the Arabidopsis thaliana PeptideAtlas proteomics resource providing protein sequence coverage, matched mass spectrometry (MS) spectra, selected PTMs, and metadata. 70 million MS/MS spectra were matched to the Araport11 annotation, identifying ∼0.6 million unique peptides and 18267 proteins at the highest confidence level and 3396 lower confidence proteins, together representing 78.6% of the predicted proteome. Additional identified proteins not predicted in Araport11 should be considered for building the next Arabidopsis genome annotation. This release identified 5198 phosphorylated proteins, 668 ubiquitinated proteins, 3050 N-terminally acetylated proteins and 864 lysine-acetylated proteins and mapped their PTM sites. MS support was lacking for 21.4% (5896 proteins) of the predicted Araport11 proteome – the ‘dark’ proteome. This dark proteome is highly enriched for certain ( e.g. CLE, CEP, IDA, PSY) but not other ( e.g. THIONIN, CAP,) signaling peptides families, E3 ligases, TFs, and other proteins with unfavorable physicochemical properties. A machine learning model trained on RNA expression data and protein properties predicts the probability for proteins to be detected. The model aids in discovery of proteins with short-half life ( e.g. SIG1,3 and ERF-VII TFs) and completing the proteome. PeptideAtlas is linked to TAIR, JBrowse, PPDB, SUBA, UniProtKB and Plant PTM Viewer.

Abstract Under anaerobic stress Arabidopsis thaliana induces the expression of a collection of core hypoxia genes that encode proteins associated with an adaptive response. Included in these core hypoxia genes is NIP2;1 , which encodes a member of the “Nodulin-like Intrinsic Protein” (NIP) subgroup of the aquaporin superfamily of membrane channel proteins. Under normal growth, NIP2;1 expression is limited to the “anoxia core” region of the root stele, but shows substantial induction in response to low oxygen stress (as high as 1000-fold by 2-4 hr of hypoxia challenge), and accumulates in all root tissues. During hypoxia, NIP2;1-GFP , accumulates on the cell surface by 2 hr and then is distributed between the cell surface and internal membranes during sustained hypoxia, and remains elevated in root tissues through 4 hrs of reoxygenation recovery. T-DNA insertional mutant nip2;1 plants show elevation of lactic acid within root tissues, and a reduced efflux of lactic acid and acidification of the external medium. Together with previous biochemical evidence demonstrating that NIP2;1 has lactic acid permease activity, the present work supports the hypothesis that the protein facilitates the release of cellular lactate to the rhizosphere to prevent lactic acid toxicity. In support of this, nip2;1 plants show poorer survival to argon-induced hypoxia stress. Nip2;1 mutant plants also show elevated expression of ethanolic fermentation transcripts, as well as reduced expression the lactate metabolic enzyme GOX3, suggesting that the altered efflux of lactate through NIP2;1 regulates other pyruvate and lactate metabolism pathways. One-sentence Summary The NIP2;1 lactic acid permease is necessary for an optimum response to low oxygen stress through the release of lactate from roots during hypoxia stress.