ABSTRACT Understanding the effects of rare genetic variants remains challenging, both in coding and non-coding regions. While multiplexed assays of variant effect (MAVEs) have enabled scalable functional assessment of variants, established MAVEs are limited by either exogenous expression of variants or constraints of genome editing. Here, we introduce a pooled prime editing (PE) platform in haploid human cells to scalably assay variants in their endogenous context. We first optimized delivery of variants to HAP1 cells, defining optimal pegRNA designs and establishing a co-selection strategy for improved efficiency. We characterize our platform in the context of negative selection by testing over 7,500 pegRNAs targeting SMARCB1 for editing activity and observing depletion of highly active pegRNAs installing loss-of-function variants. We next assess variants in MLH1 via 6-thioguanine selection, assaying 65.3% of all possible SNVs in a 200-bp region spanning exon 10 and distinguishing LoF variants with high accuracy. Lastly, we assay 362 non-coding MLH1 variants across a 60 kb region in a single experiment, identifying pathogenic variants acting via multiple mechanisms with high specificity. Our analyses detail how filtering for highly active pegRNAs can facilitate both positive and negative selection screens. Accordingly, our platform promises to enable highly scalable functional assessment of human variants.

ABSTRACT To maximize the impact of precision medicine approaches, it is critical to accurately identify genetic variants in cancer-associated genes with functional consequences. Yet, our knowledge of rare variants conferring clinically relevant phenotypes and the mechanisms through which they act remains highly limited. A tumor suppressor gene exemplifying the challenge of variant interpretation is VHL . VHL encodes an E3 ubiquitin ligase that regulates the cellular response to hypoxia. Germline pathogenic variants in VHL predispose patients to tumors including clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) and pheochromocytoma, and somatic VHL mutations are frequently observed in sporadic renal cancer. Here, we optimize and apply Saturation Genome Editing (SGE) to assay nearly all possible single nucleotide variants (SNVs) across VHL ’s coding sequence. To delineate mechanisms, we quantify mRNA dosage effects over time and compare effects in isogenic cell lines. Function scores for 2,268 VHL SNVs identify a core set of pathogenic alleles driving ccRCC with perfect accuracy, inform differential risk across tumor types, and reveal novel mechanisms by which variants impact function. These results have immediate utility for classifying VHL variants encountered in both germline testing and tumor profiling and illustrate how precise functional measurements can resolve pleiotropic and dosage-dependent genotype-phenotype relationships across complete genes.