Antibody drug conjugates (ADCs) have made impressive strides in the clinic in recent years with 11 Food and Drug Administration approvals, including 6 for the treatment of patients with solid tumors. Despite this success, the development of new agents remains challenging with a high failure rate in the clinic. Here, we show that current approved ADCs for the treatment of patients with solid tumors can all show substantial efficacy in some mouse models when administered at a similar weight-based [milligrams per kilogram (mg/kg)] dosing in mice that is tolerated in the clinic. Mechanistically, equivalent mg/kg dosing results in a similar drug concentration in the tumor and a similar tissue penetration into the tumor due to the unique delivery features of ADCs. Combined with computational approaches, which can account for the complex distribution within the tumor microenvironment, these scaling concepts may aid in the evaluation of new agents and help design therapeutics with maximum clinical efficacy.

Abstract Limitations in current imaging tools have long challenged the imaging of small pancreatic islets in animal models. Here, we report the first development and in vivo validation testing of a broad spectrum and high absorbance near infrared optoacoustic contrast agent, E4 x12 -Cy7. Our near infrared tracer (E4 x12 -Cy7) is based on the amino acid sequence of exendin-4 and targets the glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Cell assays confirmed that E4 x12 -Cy7 has a high binding affinity (IC 50 = 4.6 ± 0.8 nM). Using the multi-spectral optoacoustic tomography (MSOT), we imaged E4 x12 -Cy7 and optoacoustically visualized ß-cell insulinoma xenografts in vivo for the first time. In the future, similar optoacoustic tracers that are specific for ß-cells and combines optoacoustic and fluorescence imaging modalities could prove to be important tools for monitoring the pancreas for the progression of diabetes.

Intracellular protein-protein interactions are involved in many different diseases, making them prime targets for therapeutic intervention. Several diseases are characterized by their overexpression of Bcl-xL, an anti-apoptotic B cell lymphoma 2 (Bcl-2) protein expressed on mitochondrial membranes. Bcl-xL overexpression inhibits apoptosis, and selective inhibition of Bcl-xL has the potential to increase cancer cell death while leaving healthy cells comparatively less affected. However, high homology between Bcl-xL and other Bcl-2 proteins has made it difficult to selectively inhibit this interaction by small molecule drugs. We engineered stapled peptides, a chemical modification that can improve cell penetration, protease stability, and conformational stability, towards the selective inhibition of Bcl-xL. To accomplish this task, we built a focused combinatorial mutagenesis library of peptide variants on the bacterial cell surface, used copper catalyzed click chemistry to form stapled peptides, and sorted the library for high binding to Bcl-xL and minimal binding towards other Bcl-2 proteins. We characterized the sequence and staple placement trends that governed specificity and identified molecules with ~10 nM affinity to Bcl-xL and greater than 100-fold selectivity versus other Bcl-2 family members on and off the cell surface. We confirmed the mechanism of action of these peptides is consistent with apoptosis biology through mitochondrial outer membrane depolarization assays (MOMP). Overall, high affinity (10 nM Kd) and high specificity (100-fold selectivity) peptides were developed to target the Bcl-xL protein. These results demonstrate that stapled alpha helical peptides are promising candidates for the specific treatment of cancers driven by Bcl-2 dysregulation.

Abstract Proteins are a diverse class of biomolecules responsible for wide-ranging cellular functions, from catalyzing reactions and recognizing pathogens to forming dynamic cellular structure. The ability to evolve proteins rapidly and inexpensively towards improved properties is a common objective for protein engineers. Powerful high-throughput methods like fluorescent activated cell sorting (FACS) and next-generation sequencing (NGS) have dramatically improved directed evolution experiments. However, it is unclear how to best leverage this data to characterize protein fitness landscapes more completely and identify lead candidates. In this work, we develop a simple yet powerful framework to improve protein optimization by predicting continuous protein properties from simple directed evolution experiments using interpretable machine learning. Evaluated across five diverse protein engineering tasks, continuous properties are consistently predicted from readily available deep sequencing data. To prospectively test the utility of this approach, we generated a library of stapled peptides and applied the framework to predict and optimize both affinity and specificity. We coupled integer linear programming with the interpretable machine learning model coefficients to identify new variants from experimentally unseen sequence space that have desired properties. This approach represents a versatile tool for improved analysis and identification of protein variants across many domains of protein engineering.

Antibody-drug conjugates (ADCs) have experienced a surge in clinical approvals in the past five years. Despite this success, a major limitation to ADC efficacy in solid tumors is poor tumor penetration, which leaves many cancer cells untargeted. Increasing antibody doses or co-administering ADC with an unconjugated antibody can improve tumor penetration and increase efficacy when target receptor expression is high. However, it can also reduce efficacy in low-expression tumors where ADC delivery is limited by cellular uptake. This creates an intrinsic problem because many patients express different levels of target between tumors and even within the same tumor. Here, we generated High-Avidity, Low-Affinity (HALA) antibodies that can automatically tune the cellular ADC delivery to match the local expression level. Using HER2 ADCs as a model, HALA antibodies were identified with the desired HER2 expression-dependent competitive binding with ADCs