A SARS-CoV-2 variant carrying the Spike protein amino acid change D614G has become the most prevalent form in the global pandemic. Dynamic tracking of variant frequencies revealed a recurrent pattern of G614 increase at multiple geographic levels: national, regional, and municipal. The shift occurred even in local epidemics where the original D614 form was well established prior to introduction of the G614 variant. The consistency of this pattern was highly statistically significant, suggesting that the G614 variant may have a fitness advantage. We found that the G614 variant grows to a higher titer as pseudotyped virions. In infected individuals, G614 is associated with lower RT-PCR cycle thresholds, suggestive of higher upper respiratory tract viral loads, but not with increased disease severity. These findings illuminate changes important for a mechanistic understanding of the virus and support continuing surveillance of Spike mutations to aid with development of immunological interventions.

Genetic variations across the SARS-CoV-2 genome may influence transmissibility of the virus and the host’s anti-viral immune response, in turn affecting the frequency of variants over-time. In this study, we examined the adjacent amino acid polymorphisms in the nucleocapsid (R203K/G204R) of SARS-CoV-2 that arose on the background of the spike D614G change and describe how strains harboring these changes became dominant circulating strains globally.Deep sequencing data of SARS-CoV-2 from public databases and from clinical samples were analyzed to identify and map genetic variants and sub-genomic RNA transcripts across the genome.Sequence analysis suggests that the three adjacent nucleotide changes that result in the K203/R204 variant have arisen by homologous recombination from the core sequence (CS) of the leader transcription-regulating sequence (TRS) rather than by stepwise mutation. The resulting sequence changes generate a novel sub-genomic RNA transcript for the C-terminal dimerization domain of nucleocapsid. Deep sequencing data from 981 clinical samples confirmed the presence of the novel TRS-CS-dimerization domain RNA in individuals with the K203/R204 variant. Quantification of sub-genomic RNA indicates that viruses with the K203/R204 variant may also have increased expression of sub-genomic RNA from other open reading frames.The finding that homologous recombination from the TRS may have occurred since the introduction of SARS-CoV-2 in humans resulting in both coding changes and novel sub-genomic RNA transcripts suggests this as a mechanism for diversification and adaptation within its new host.

ABSTRACT The Arenaviridae family within the Bunyavirales order of segmented RNA viruses contains over 50 species grouped into four genera, Antennavirus , Hartmanivirus , Mammarenavirus and Reptarenavirus . Several mammarenaviruses are associated with fatal hemorrhagic fevers, including Lassa, Lujo and Junin viruses. The mammarenavirus member lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is largely non-pathogenic to humans and represents a tractable model system for studying arenavirus molecular and cellular biology. During infection of cells in culture, a high proportion of LCMV spread is between directly neighbouring cells. Consistent with this observation LCMV-infected cells extrude multiple tunnelling nanotube (TNT)-like structures forming intercellular connections that could provide a route of cell-to-cell spread. To investigate this, we used recombinant LCMV with engineered epitope tags in glycoprotein spike (GP-1) and matrix (Z) proteins, alongside nucleoprotein (NP) antisera, to reveal that all three major structural proteins co-localised within TNT-like connections. Furthermore, utilising fluorescent in situ hybridisation (FISH) we showed NP also co-localised with LCMV genomic sense RNA. Taken together, these observations suggested LCMV virions pass between cells through intercellular connections to infect new cells. Consistent with this, addition of a potent LCMV neutralising antibody to supernatants during infection failed to block LCMV spread through cultures, revealing that cell-to-cell connectivity plays a major role in LCMV transmission. This is the first report of cell-cell infection via TNT-like connections for any species of the 14 families within the Bunyavirales order. This study furthers our understanding of how arenaviruses manipulate the host to establish infection, which may aid in the development of effective anti-viral therapeutics. IMPORTANCE Arenaviruses include some of the most serious human pathogens in existence, although no clinically approved vaccines or therapies are currently available to prevent their associated disease. As with most pathogens, transmission of arenaviruses from one cell to another is a critical aspect of infection and resulting pathogenicity. Here, we showed that model arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) can spread between cells without exposure to the extracellular space. We visualized the three major LCMV structural proteins, namely nucleoprotein, glycoprotein spike and matrix co-localized along with genomic RNA within tubular structures connecting adjacent cells. The use of a potent neutralizing antibody to block the extracellular route of LCMV transmission reduced spread within cultured cells to approximately half that of untreated cultures. Taken together, these results suggest intercellular connections represent important conduits for arenavirus spread. This information will aid in the development of antiviral strategies that prevent both intra- and extracellular transmission routes.

ABSTRACT Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is a model arenavirus that causes fatalities within immunocompromised populations. To enter cells, the LCMV envelope fuses with endosomal membranes, for which two requirements are low pH and interaction between LCMV GP spike and receptor CD164. LCMV subsequently uncoats, where genome-associated NP separates from Z matrix. To further examine LCMV entry, an siRNA screen identified K + channels as important for LCMV infection, and pharmacological inhibition confirmed K + involvement during entry. We tracked incoming virions along their entry pathway under physiological conditions, where uncoating was signified by separation of NP and Z. In contrast, K + channel blockade, prevented uncoating, trapping virions within Rab7 and CD164-positive endosomes, identifying K + as a third LCMV entry requirement. K + did not increase GP/CD164 binding, thus we suggest K + mediates uncoating by modulating NP/Z interactions within the virion interior. These results suggest repurposing licensed K + channel inhibitors represents a potential anti-arenaviral strategy.

Abstract The Arenaviridae family of segmented RNA viruses contains nearly 70 species with several associated with fatal haemorrhagic fevers, including Lassa, Lujo and Junin viruses. Lymphocytic choriomeningitis arenavirus (LCMV) is associated with fatal neurologic disease in humans and additionally represents a tractable model for studying arenavirus biology. Within cultured cells, a high proportion of LCMV spread is between directly neighbouring cells, suggesting infectivity may pass through intercellular connections, bypassing the canonical extracellular route involving egress from the plasma membrane. Consistent with this, we visualized abundant actin- and tubulin-rich connections conjoining LCMV-infected and uninfected cells within cultures, resembling tunnelling nanotubes (TNTs). Within these TNT-like connections, confocal and STED microscopy identified puncta containing the major structural components of LCMV virions alongside genomic RNA, consistent with intercellular transit of assembled virions or ribonucleoprotein genome segments. Blocking the extracellular route of infection by adding potent LCMV neutralising antibody M28 to supernatants during infection revealed around 50% of LCMV transmission was via intercellular connections. These results show arenaviruses transmission is more complex than previously thought involving both extracellular and intercellular routes.