More than two million people worldwide are affected by life-threatening, invasive fungal infections annually. Candida species are the most common cause of nosocomial, invasive fungal infections and are associated with mortality rates above 40%. Despite the increasing incidence of drug-resistance, the development of novel antifungal formulations has been limited. Here we investigate the antifungal mode of action and therapeutic potential of positively charged, synthetic peptide mimics to combat Candida albicans infections. Our data indicates that these synthetic polymers cause endoplasmic reticulum stress and affect protein glycosylation, a mode of action distinct from currently approved antifungal drugs. The most promising polymer composition damaged the mannan layer of the cell wall, with additional membrane-disrupting activity. The synergistic combination of the polymer with caspofungin prevented infection of human epithelial cells in vitro, improved fungal clearance by human macrophages, and significantly increased host survival in a Galleria mellonella model of systemic candidiasis. Additionally, prolonged exposure of C. albicans to the synergistic combination of polymer and caspofungin did not lead to the evolution of tolerant strains in vitro. Together, this work highlights the enormous potential of these synthetic peptide mimics to be used as novel antifungal formulations as well as adjunctive antifungal therapy.

Cryptococcus neoformans is a fungus classified by the World Health Organization as a critically important pathogen, which poses a significant threat to immunocompromised individuals. In this study, we present the chemical synthesis and evaluation of two semisynthetic vaccine candidates targeting the capsular polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) of C. neoformans. These semisynthetic glycoconjugate vaccines contain an identical synthetic decasaccharide (M2 motif) antigen. This antigen is present in serotype A strains, which constitute 95% of the clinical cryptococcosis cases. This synthetic oligosaccharide was conjugated to two proteins (CRM197 and Anthrax 63 kDa PA) and tested for immunogenicity in mice. The conjugates elicited a specific antibody response that bound to the M2 motif but also exhibited additional cross-reactivity toward M1 and M4 GXM motifs. Both glycoconjugates produced antibodies that bound to GXM in ELISA assays and to live fungal cells. Mice immunized with the CRM197 glycoconjugate produced weakly opsonic antibodies and displayed trends toward increased median survival relative to mice given a mock PBS injection (18 vs 15 days, p = 0.06). These findings indicate promise, achieving a successful vaccine demands further optimization of the glycoconjugate. This antigen could serve as a component in a multivalent GXM motif vaccine.

Abstract More than two million people worldwide are affected by life-threatening, invasive fungal infections annually. Candida species are the most common cause of nosocomical, invasive fungal infections and are associated with mortality rates above 40%. Despite the increasing incidence of drug-resistance, the development of novel antifungal formulations has been limited. Here we investigate the antifungal mode of action and therapeutic potential of positively charged, synthetic peptide mimics to combat infections by Candida albicans . These synthetic polymers cause stress to the endoplasmic reticulum and affect protein glycosylation, a distinct mode of action compared to currently approved antifungal drugs. The most promising polymer composition caused damage to the mannan layer of the cell wall, with additional membrane-disrupting activity. The synergistic combination of the polymer with caspofungin prevented infection of human epithelial cells in vitro , improved fungal clearance by human macrophages, and significantly increased host survival in a Galleria mellonella model of systemic candidiasis. Additionally, prolonged exposure of C. albicans to the synergistic combination of polymer and caspofungin did not lead to the evolution of resistant strains in vitro . Together, this work highlights the enormous potential of these synthetic peptide mimics to be used as novel antifungal formulations as well as adjunctive antifungal therapy.

Outer membrane vesicles produced by Gram-negative bacteria have been studied for half a century but the possibility that Gram-positive bacteria secreted extracellular vesicles (EVs) was not pursued due to the assumption that the thick peptidoglycan cell wall would prevent their release to the environment. However, following discovery in fungi, which also have cell walls, EVs have now been described for a variety of Gram-positive bacteria. EVs purified from Gram-positive bacteria are implicated in virulence, toxin release and transference to host cells, eliciting immune responses, and spread of antibiotic resistance. Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium that is the etiological agent of listeriosis. Here we report that L. monocytogenes produces EVs with diameter ranging from 20-200 nm, containing the pore-forming toxin listeriolysin O (LLO) and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC). Using simultaneous metabolite, protein, and lipid extraction (MPLEx) multi-omics we characterized protein, lipid and metabolite composition of bacterial cells and secreted EVs and found that EVs carry the majority of listerial virulence proteins. Cell-free EV preparations were toxic to the murine macrophage cell line J774.16, in a LLO-dependent manner, evidencing EV biological activity. The deletion of plcA increased EV toxicity, suggesting PI-PLC can restrain LLO activity. Using immunogold electron microscopy we detect LLO localization at several organelles within infected human epithelial cells and with high-resolution fluorescence imaging we show that dynamic lipid structures are released from L. monocytogenes that colocalize with LLO during infection. Our findings demonstrate that L. monocytogenes utilize EVs for toxin release and implicate these structures in mammalian cytotoxicity.

Cryptococcus neoformans is an environmental pathogenic fungus with a worldwide geographical distribution that is responsible for hundreds of thousands human cryptococcosis cases each year. During infection, the yeast undergoes a morphological transformation involving capsular enlargement that increases microbial volume. To understand the factors that play a role in environmental dispersal of C. neoformans and C. gatii we evaluated the buoyant cell density of Cryptococcus using Percoll isopycnic gradients. We found differences in the buoyant cell density of strains belonging to C. neoformans and C. gatii species complexes. The buoyant cell density of C. neoformans strains varied depending on growth medium conditions. In minimal medium, the cryptococcal capsule made a major contribution to the buoyant cell density such that cells with larger capsules had lower density than those with smaller capsules. Removing the capsule, both by chemical or mechanical methods, decreased the C. neoformans cell density. Melanization of the C. neoformans cell wall, which also contributes to virulence, produced a small but consistent increase in cell density. C. neoformans sedimented much slower in seawater as its density approached the density of water. Our results suggest a new function for the capsule whereby it can function as a flotation device to facilitate transport and dispersion in aqueous fluids.

Tissue stiffness is a critical prognostic factor in breast cancer and is associated with metastatic progression. Here we show an alternative and complementary hypothesis of tumor progression whereby physiological matrix stiffness affects the quantity and protein cargo of small EVs produced by cancer cells, which in turn drive their metastasis. Primary patient breast tissue produces significantly more EVs from stiff tumor tissue than soft tumor adjacent tissue. EVs released by cancer cells on matrices that model human breast tumors (25 kPa; stiff EVs) feature increased adhesion molecule presentation (ITGα 2 β 1 , ITGα 6 β 4 , ITGα 6 β 1 , CD44) compared to EVs from softer normal tissue (0.5 kPa; soft EVs), which facilitates their binding to extracellular matrix (ECM) protein collagen IV, and a 3-fold increase in homing ability to distant organs in mice. In a zebrafish xenograft model, stiff EVs aid cancer cell dissemination through enhanced chemotaxis. Moreover, normal, resident lung fibroblasts treated with stiff and soft EVs change their gene expression profiles to adopt a cancer associated fibroblast (CAF) phenotype. These findings show that EV quantity, cargo, and function depend heavily on the mechanical properties of the extracellular microenvironment.

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are pathogenic fungi that cause significant morbidity and mortality. Cell surface hydrophobicity (CSH) is a biophysical parameter that influences the adhesion of fungal cells or spores to biotic and abiotic surfaces. C. neoformans is encased by polysaccharide capsule that is highly hydrophilic and is a critical determinant of virulence. In this study, we report large differences in the CSH of some C. neoformans and C. gattii strains. The capsular polysaccharides of C. neoformans strains differ in repeating motifs, and therefore vary in the number of hydroxyl groups, which along with higher-order structure of the capsule, may contribute to the variation in hydrophobicity that we observed. For C. neoformans, CSH correlated with phagocytosis by natural soil predator Acanthamoeba castellani. Furthermore, capsular binding of the protective antibody (18B7), but not the non-protective (13F1) antibody altered the CSH of C. neoformans strains. Variability in CSH could be an important characteristic when comparing the biological properties of cryptococcal strains.

Abstract The fungus Cryptococcus neoformans is a major human pathogen with a remarkable intracellular survival strategy that includes exiting macrophages through non-lytic exocytosis (Vomocytosis) and transferring between macrophages (Dragotcytosis) by a mechanism that involves sequential events of non-lytic exocytosis and phagocytosis. Vomocytosis and Dragotcytosis are fungal driven processes, but their triggers are not understood. We hypothesized that the dynamics of Dragotcytosis could inherit the stochasticity of phagolysosome acidification and that Dragotcytosis was triggered by fungal cell stress. Consistent with this view, fungal cells involved in Dragotcytosis reside in phagolysosomes characterized by low pH and/or high oxidative stress. Using fluorescent microscopy, qPCR, live cell video microscopy, and fungal growth assays we found that the that mitigating pH or oxidative stress abrogated Dragotcytosis frequency, that ROS susceptible mutants of C. neoformans underwent Dragotcytosis more frequently. Dragotcytosis initiation was linked to phagolysosomal pH and oxidative stresses and correlated with the macrophage polarization state. Dragotcytosis manifested stochastic dynamics thus paralleling the dynamics of phagosomal acidification, which correlated with the inhospitality of phagolysosomes in differently polarized macrophages. Hence, randomness in phagosomal acidification randomly created a population of inhospitable phagosomes where fungal cell stress triggered stochastic C. neoformans non-lytic exocytosis dynamics to escape a non-permissive intracellular macrophage environment.

Melanins are synthesized macromolecules that are found in all biological kingdoms. These pigments have a myriad of roles that range from microbial virulence to key components of the innate immune response in invertebrates. Melanins also exhibit unique properties with potential applications in physics and material sciences, ranging from electrical batteries to novel therapeutics. In the fungi, melanins such as eumelanins, are components of the cell wall that provide protection against biotic and abiotic elements. Elucidation of the smallest fungal cell wall-asociated melanin unit that serves as a building block is critical to understand the architecture of these polymers, its interaction with surrounding components, and their functional versatility. In this study, we used isopycnic gradient sedimentation, NMR, EPR, high-resolution microscopy, and proteomics to analyze the melanin in the cell wall of the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. We observed that melanin is assembled into the cryptococcal cell wall in spherical structures of ~200 nm in diameter, termed melanin granules, which are in turn composed of nanospheres of ~30 nm in diameter, the fungal melanosomes. We noted that melanin granules are closely associated with proteins that may play critical roles in the fungal melanogenesis and the supramolecular structure of this polymer. Using this structural information, we propose a model for C. neoformans melanization that is similar to the process used in animal melanization and is consistent with the phylogenetic relatedness of the fungal and animal kingdoms.

Cryptococcus neoformans is a fungus classified by the World Health Organization as a critically important pathogen, posing a significant threat to immunocompromised individuals. In this study, we present the chemical synthesis and evaluation of two semi-synthetic vaccine candidates targeting the capsular polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) of C. neoformans. These semi-synthetic glycoconjugate vaccines contain the identical synthetic decasaccharide (M2 motif) antigen. This motif is present in serotype A strains, which constitute 95% of clinical cryptococcosis cases. This synthetic oligosaccharide was conjugated to two proteins (CRM197 and Anthrax 63 kDa PA) and tested for immunogenicity in mice. The conjugates elicited a specific antibody response that bound to the M2 motif but also exhibited additional cross-reactivity towards M1 and M4 GXM motifs. Both glycoconjugates produced antibodies that bound to GXM in ELISA assays and to live fungal cells. Mice immunized with the CRM197 glycoconjugate produced opsonic antibodies and displayed trends toward increased median survival relative to mice given a mock PBS injection (18 vs 15 days, p = 0.06). While these findings indicate promise, achieving a successful vaccine demands further optimization of the glycoconjugate. It could serve as a component in a multi-valent GXM motif vaccine, enhancing both strength and breadth of immune responses.