The stress-bearing component of the bacterial cell wall--a multi-gigadalton bag-like molecule called the sacculus--is synthesized from peptidoglycan. Whereas the chemical composition and the 3-dimensional structure of the peptidoglycan subunit (in at least one conformation) are known, the architecture of the assembled sacculus is not. Four decades' worth of biochemical and electron microscopy experiments have resulted in two leading 3-D peptidoglycan models: "Layered" and "Scaffold", in which the glycan strands are parallel and perpendicular to the cell surface, respectively. Here we resolved the basic architecture of purified, frozen-hydrated sacculi through electron cryotomography. In the Gram-negative sacculus, a single layer of glycans lie parallel to the cell surface, roughly perpendicular to the long axis of the cell, encircling the cell in a disorganized hoop-like fashion.

SUMMARY Nuclear processes depend on the organization of chromatin, whose basic units are cylinder-shaped complexes called nucleosomes. A subset of mammalian nucleosomes in situ (inside cells) resembles the canonical structure determined in vitro 25 years ago. Nucleosome structure in situ is otherwise poorly understood. Using cryo-ET and 3-D classification analysis of budding yeast cells, here we find that canonical nucleosomes account for less than 10% of total nucleosomes expected in situ . In a strain in which H2A-GFP is the sole source of histone H2A, class averages that resemble canonical nucleosomes both with and without GFP densities are found ex vivo (in nuclear lysates), but not in situ . These data suggest that the budding yeast intranuclear environment favors multiple non-canonical nucleosome conformations. Using the structural observations here and the results of previous genomics and biochemical studies, we propose a model in which the average budding yeast nucleosome’s DNA is partially detached in situ .

Abstract In meiosis, cells undergo two sequential rounds of cell division, termed meiosis I and meiosis II. Textbook models of the meiosis I substage called pachytene show that nuclei have conspicuous 100-nm-wide, ladder-like synaptonemal complexes (SC), which form between homologous chromosomes. It remains unknown if cells have any other large, meiosis-specific nuclear structures. Here we present cryo-ET analysis of frozen-hydrated budding yeast cells before, during, and after pachytene. We found no evidence for the dense ladder-like structures expected of the SC or the ordered chromatin loops expected to project from their sides. Instead, we found large quantities of 12-nm-wide triple-helices that pack into crystalline bundles. These structures are present in meiotic cells, but not in interphase cells, so we call them meiotic triple helices (MTHs). MTHs are enriched in the nucleus but not enriched in the cytoplasm. Bundles of MTHs form at the same time as SCs in wild-type cells and also in mutant cells that are unable to form SCs. These results suggest that in yeast, SCs are not crystalline and that they coexist with large, previously unreported meiotic machines.

ABSTRACT The structure of chromatin at the nucleosome level inside cells is mysterious. Here we present in situ cryo-ET analyses of chromatin in both G1 and metaphase RPE-1 cells. G1 nucleosomes are concentrated in globular chromatin domains and metaphase nucleosomes are concentrated in the chromatids. Classification analysis reveals that canonical mononucleosomes, ordered stacked dinucleosomes, and mononucleosomes with a disordered gyre-proximal density are abundant in both cell-cycle states. Class averages that have more than two stacked nucleosomes or that have side-by-side dinucleosomes are not detected, suggesting that groups of more than two nucleosomes are heterogeneous. Large multi-megadalton structures are abundant in G1 nucleoplasm, but not found in G1 chromatin domains and metaphase chromatin. The macromolecular phenotypes studied here represent a starting point for the comparative analysis of condensation in normal and unhealthy human cells, in other cell-cycle states, other organisms, and in vitro chromatin assemblies.

Abstract The in situ 3-D organization of chromatin at the nucleosome and oligonucleosome levels is unknown. Here we use cryo-electron tomography (cryo-ET) to determine the in situ structures of HeLa nucleosomes, which have canonical core structures and asymmetric, flexible linker DNA. Subtomogram remapping suggests that sequential nucleosomes in heterochromatin follow irregular paths at the oligonucleosome level. This basic principle of higher-order repressive chromatin folding is compatible with the conformational variability of the two linker DNAs at the single-nucleosome level.

Background: Cells are powered by a large set of macromolecular complexes, which work together in a crowded environment. The in situ mechanisms of these complexes are unclear because their 3-D distribution, organization, and interactions are largely unknown. Electron cryotomography (cryo-ET) is a key tool to address these knowledge gaps because it produces cryotomograms -- 3-D images that reveal biological structure at approximately 4-nm resolution. Cryo-ET does not involve any fixation, dehydration, staining, or plastic embedment, meaning that cellular features are visualized in a life-like, frozen-hydrated state. To study chromatin and mitotic machinery in situ, we have subjected yeast cells to a variety of genetic and/or chemical perturbations, cryosectioned them, and then imaged the cells by cryo-ET. Findings: Every study from our group has generated more cryo-ET data than needed. Only the small subset of data that contributed to figures in these studies have been publicly shared. Here we share more than 1,000 cryo-ET raw datasets of cryosectioned budding yeast S. cerevisiae. This data will be valuable to cell biologists who are interested in the nanoscale organization of yeasts and of eukaryotic cells in general. To facilitate access, all the unpublished tilt series and a subset of corresponding cryotomograms have been deposited in the EMPIAR resource for the cell-biology community to use freely. To improve tilt series discoverability, we have uploaded metadata and preliminary notes to publicly accessible google spreadsheets. Conclusions: Cellular cryo-ET data can be mined to obtain new cell-biological, structural, and 3-D statistical insights in situ. Because these data capture cells in a life-like state, they contain some structures that are either absent or not visible in traditional EM data. Template matching and subtomogram averaging of known macromolecular complexes can reveal their 3-D distributions and low-resolution structures. Furthermore, these data can serve as testbeds for high-throughput image-analysis pipelines, as training sets for feature-recognition software, for feasibility analysis when planning new structural cell-biology projects, and as practice data for students who are learning cellular cryo-ET.

In dividing cells, depolymerizing spindle microtubules move chromosomes by pulling at their kinetochores. While kinetochore subcomplexes have been studied extensively in vitro, little is known about their in vivo structure and interactions with microtubules or their response to spindle damage. Here we combine electron cryotomography of serial cryosections with genetic and pharmacological perturbation to study the yeast chromosome-segregation machinery at molecular resolution in vivo. Each kinetochore microtubule has one (rarely, two) Dam1C/DASH outer-kinetochore assemblies. Dam1C/DASH only contacts the flat surface of the microtubule and does so with its flexible "bridges". In metaphase, 40% of the Dam1C/DASH assemblies are complete rings; the rest are partial rings. Ring completeness and binding position along the microtubule are sensitive to kinetochore attachment and tension, respectively. Our study supports a model in which each kinetochore must undergo cycles of conformational change to couple microtubule depolymerization to chromosome movement.

Cells change their cytology in response to environmental cues and stress. Notably, large changes in nuclear architecture are accompanied by transcriptional reprogramming. When starved of nitrogen, Schizosaccharomyces pombe cells become rounder and they enter a quiescent "G0" state. These cells have smaller nuclei and undergo near-global transcriptional repression. Here we use electron cryotomography (cryo-ET) and cell-biology approaches to investigate the structural and biochemical changes of G0 S. pombe nuclei. We find that G0 cells have a denser nucleoplasm and fewer chromatin-associated multi-megadalton globular complexes (megacomplexes) than proliferating cells. These structural changes are correlated with mild histone deacetylation. Induced histone hyperacetylation in G0 results in cells that have larger nuclei and less condensed chromatin. However, these histone-hyperacetylated G0 cells still have repressed transcription, few megacomplexes, and a dense nucleoplasm. Like in budding yeast, S. pombe G0 nuclear phenotypes are controlled by multiple biochemical factors.

The 30-nm fiber is commonly found in oligonucleosome arrays in vitro but rarely found in chromatin within nuclei. To determine how chromatin high-order structure is controlled, we used cryo-ET to study the undigested natural chromatin released from cells that do not have evidence of 30-nm fibers in vivo: picoplankton and yeast. In the presence of divalent cations, most of the chromatin from both organisms is compacted into a large mass. Rare irregular 30-nm fibers do form at the periphery of this mass, some of which include face-to-face interactions. In the absence of divalent cations, picoplankton chromatin decondenses into open zigzags. By contrast, yeast chromatin mostly remains compact with looser nucleosome packing, even after treatment with histone-deacetylase inhibitor. The 3-D configuration of natural chromatin is therefore sensitive to the local environment, but generally nonpermissive of regular motifs, even at the level of oligonucleosomes.

At the onset of mitosis, chromosomes condense into discrete bodies. This transformation involves rearrangement at the nucleosome level and has consequences for transcription, but the details remain unclear. Here, we use cryo-electron tomography to determine the 3-D arrangement of nucleosomes and other large nuclear features in interphase and mitotic fission yeast cells. Nucleosomes can form heterogenous clusters in both interphase and mitotic cells, but none the size of a Hi-C domain. Furthermore, the nucleosomes are mingled with two features: nucleosome-free pockets and ribosome-sized 'megacomplexes'. Compared to interphase chromatin, the nucleosomes in mitotic chromatin pack in larger clusters. Furthermore, mitotic chromatin contained fewer megacomplexes. However, nearest-neighbor distance analysis revealed that mitotic nucleosome clusters have the same packing density as in interphase. Therefore, the uneven chromosome condensation helps explain a longstanding enigma of mitosis: most genes are silenced but a subset is upregulated.