ABSTRACT Cyanobacterial CO 2 concentrating mechanisms (CCMs) sequester a globally significant proportion of carbon into the biosphere. Proteinaceous microcompartments, called carboxysomes, play a critical role in CCM function, housing two enzymes to enhance CO 2 fixation: carbonic anhydrase (CA) and Rubisco. Despite its importance, our current understanding of the carboxysomal CAs found in ɑ-cyanobacteria, CsoSCA, remains limited, particularly regarding the regulation of its activity. Here, we present the first structural and biochemical study of CsoSCA from the cyanobacterium Cyanobium PCC7001 . Our results show that the Cyanobium CsoSCA is allosterically activated by the Rubisco substrate ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP), and forms a hexameric trimer of dimers. Comprehensive phylogenetic and mutational analyses are consistent with this regulation appearing exclusively in cyanobacterial ɑ-carboxysome CAs. These findings clarify the biologically relevant oligomeric state of α-carboxysomal CAs and advance our understanding of the regulation of photosynthesis in this globally dominant lineage. One-Sentence Summary The carboxysomal carbonic anhydrase, CsoSCA, is allosterically activated by the Rubisco substrate RuBP, revealing a novel mechanism controlling key enzyme activity in cyanobacterial α-carboxysomes.

Protein language models (PLMs) convert amino acid sequences into the numerical representations required to train machine learning (ML) models. Many PLMs are large (>600 M parameters) and trained on a broad span of protein sequence space. However, these models have limitations in terms of predictive accuracy and computational cost. Here, we use multiplexed Ancestral Sequence Reconstruction (mASR) to generate small but focused functional protein sequence datasets for PLM training. Compared to large PLMs, this local ancestral sequence embedding (LASE) produces representations 10-fold faster and with higher predictive accuracy. We show that due to the evolutionary nature of the ASR data, LASE produces smoother fitness landscapes in which protein variants that are closer in fitness value become numerically closer in representation space. This work contributes to the implementation of ML-based protein design in real-world settings, where data is sparse and computational resources are limited.

ABSTRACT Membraneless organelles containing the enzyme Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) are a common feature of organisms utilizing CO 2 concentrating mechanisms (CCMs) to enhance photosynthetic carbon acquisition. In cyanobacteria and proteobacteria, the Rubisco condensate is encapsulated in a proteinaceous shell, collectively termed a carboxysome, while some algae and hornworts have evolved Rubisco condensates known as pyrenoids. In both cases, CO 2 fixation is enhanced compared with the free enzyme. Previous mathematical models have attributed the improved function of carboxysomes to the generation of elevated CO 2 within the organelle via a co-localized carbonic anhydrase (CA), and inwardly diffusing HCO 3 - which has accumulated in the cytoplasm via dedicated transporters. Here we present a novel concept in which we consider the net of two protons produced in every Rubisco carboxylase reaction. We evaluate this in a reaction-diffusion, compartment model to investigate functional advantages these protons may provide Rubisco condensates and carboxysomes, prior to the evolution of HCO3 - accumulation. Our model highlights that diffusional resistance to reaction species within a condensate allows Rubisco-derived protons to drive the conversion of HCO 3 - to CO 2 via co-localized CA, enhancing both condensate [CO 2 ] and Rubisco rate. Protonation of Rubisco substrate (RuBP) and product (PGA) plays an important role in modulating internal pH and CO 2 generation. Application of the model to putative evolutionary ancestors, prior to contemporary cellular HCO 3 - accumulation, revealed photosynthetic enhancements along a logical sequence of advancements, via Rubisco condensation, to fully-formed carboxysomes. Our model suggests that evolution of Rubisco condensation could be favored under low CO 2 and low light environments.

In this issue of Structure, Kong et al. utilized cryoelectron tomography to closely examine Rubisco packaging within β-carboxysomes. They observed unique Rubisco packaging arrangements that may have important implications for carboxysome structural integrity.

Proteins evolve through complex sequence spaces, with fitness landscapes serving as a conceptual framework that links sequence to function. Fitness landscapes can be smooth, where multiple similarly accessible evolutionary paths are available, or rugged, where the presence of multiple local fitness optima complicate evolution and prediction. Indeed, many proteins, especially those with complex functions or under multiple selection pressures, exist on rugged fitness landscapes. Here we discuss the theoretical framework that underpins our understanding of fitness landscapes, alongside recent work that has advanced our understanding - particularly the biophysical basis for smoothness versus ruggedness. Finally, we address the rapid advances that have been made in computational and experimental exploration and exploitation of fitness landscapes, and how these can identify efficient routes to protein optimization.

Protein evolution underpins life, and understanding its behavior as a system is of great importance. However, our current models of protein evolution are arguably too simplistic to allow quantitative interpretation and prediction of evolutionary trajectories. Viewing protein evolution as a complex system has the potential to advance our understanding and ability to model protein evolution. In this perspective, we discuss aspects of protein evolution that are typical of complex systems, from nonlinear dynamics, sensitivity to initial conditions, self-organization, and the emergence of order from chaos and disorder. We discuss how the growth in sequence and structural data, insights from laboratory evolution and new machine learning tools can advance the study of protein evolution and that by treating protein evolution as a complex adaptive system, we may gain new insights into the fundamental principles driving biological innovation and adaptation and apply this to protein engineering and design.