Critical Gram-negative pathogens, like Pseudomonas, Stenotrophomonas and Burkholderia, have become resistant to most antibiotics. Complex resistance profiles together with synergistic interactions between these organisms increase the likelihood of treatment failure in distinct infection settings, for example in the lungs of cystic fibrosis patients. Here, we discover that cell envelope protein homeostasis pathways underpin both antibiotic resistance and cross-protection in CF-associated bacteria. We find that inhibition of oxidative protein folding inactivates multiple species-specific resistance proteins. Using this strategy, we sensitize multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa to β-lactam antibiotics and demonstrate promise of new treatment avenues for the recalcitrant pathogen Stenotrophomonas maltophilia. The same approach also inhibits cross-protection between resistant S. maltophilia and susceptible P. aeruginosa, allowing eradication of both commonly co-occurring CF-associated organisms. Our results provide the basis for the development of next-generation strategies that target antibiotic resistance, while also impairing specific interbacterial interactions that enhance the severity of polymicrobial infections.

Abstract Backgrounds Secondary messenger signalling systems play a crucial role in bacterial capability to respond to environmental changes by mediating alternations in transcription, translation and enzyme activity. Secondary messengers are central regulators of various aspects of bacterial life including metabolism, pathogenicity, sessility and cell morphology. Indeed, these molecules are widely recognized mediators of virulence and antibiotic tolerance in well studied pathogens such as Pseudomonas aeruginosa, where over 40 enzymes contain domains with the predicted potential to influence secondary messenger levels. The MDR nosocomial pathogen Acinetobacter baumannii has become increasingly prevalent over the last 20 years with carbapenem-resistant strains surpassing P. aeruginosa to become the WHO top priority pathogen. Despite this, relatively little is known about the role of secondary messengers in A. baumannii pathogenicity. Methods In this work, we used high-throughput screening of the A. baumannii AB5075 transposon mutant library to identify novel regulators of biofilm formation. Amongst the hits were genes predicted to influence secondary messenger levels. We further characterized the candidate with the strongest biofilm phenotype and uncovered a range of other phenotypes such as motility, exopolysaccharide production, virulence, antibiotic resistance and link with other signalling systems. Results RNA-Seq analysis of a clean deletion mutant compared with a complemented strain showed that operons and genes linked to the observed phenotypes such as pgaABCD, csuA/BABCDE and type IV pili genes were differentially expressed. Moreover, antibiotic resistance and virulence in an in vivo model were directly affected too. Conclusions Overall, we demonstrate the important role of secondary messenger signalling in A. baumannii and confirm that it modulates key phenotypes linked to virulence and antimicrobials resistance.

Abstract Hospital associated infections and localised hospital outbreaks are a major challenge for infection control teams (ICTs) in hospitals around the world. Advances in artificial intelligence and infection modelling have enabled ICT teams to better predict and trace infection spread. However, it is notoriously difficult to replicate bacterial dissemination or validate prediction models in a laboratory setting due to a lack of effective in vivo models. In this work, we sought to develop Galleria mellonella as a model organism to replicate the dissemination of pathogens in a hospital intensive care unit (ICU). By combining this model organism with 3D printed models of a real hospital ICU, we are able to demonstrate that larvae do disseminate the multidrug resistant pathogen Acinetobacter baumannii within this ICU model and that it is possible to use this model to identify infection hotspots. Importantly, this model can also be used for intervention strategy testing as we also show that bacterial dissemination can be significantly mitigated by the introduction of antimicrobial wall surface coatings. This model provides a robust platform for the testing of antimicrobial surface coatings as well as the study of genetic determinants with a role in pathogen dissemination.

Structured synopsis Background The current mutagenesis tools for Acinetobacter baumannii leave selection markers or residual sequences behind, or involve tedious counterselection and screening steps. Furthermore, they are usually adapted for model strains, rather than to multidrug resistant (MDR) clinical isolates. Objectives To develop a scar-free genome editing tool suitable for chromosomal and plasmid modifications in MDR A. baumannii AB5075. Methods We prove the efficiency of our adapted genome editing system by deleting the multidrug efflux pumps craA and cmlA5 , as well as curing plasmid p1AB5075. We then characterised the antibiotic sensitivity phenotype of the mutants compared to the wild type for chloramphenicol, tobramycin and amikacin by disc diffusion assays and determined their minimum inhibitory concentration for each strain. Results We successfully adapted the genome editing protocol to A. baumannii AB5075, achieving a double recombination frequency close to 100% and securing the construction of a mutant within 10 work days. Furthermore, we show that the Δ craA has a strong sensitivity to chloramphenicol, tobramycin and amikacin, whereas the Δ cmlA5 mutant does not show a significant decrease in viability for the antibiotics tested. On the other hand, the removal of p1AB5075 produced an increased sensitivity to tobramycin and amikacin. Conclusion We have adapted a highly efficient genome editing tool for A. baumannii and proved that craA has a broader substrate range than previously thought. On the other hand, whereas cmlA5 is annotated as a chloramphenicol efflux pump and is encoded within an aminoglycoside resistance island, it does not provide resistance to any of those compounds.

ABSTRACT Antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria is one of the greatest threats to global health. New antibacterial strategies are urgently needed, and the development of antibiotic adjuvants that either neutralize resistance proteins or compromise the integrity of the cell envelope is of ever-growing interest. Most available adjuvants are only effective against specific resistance proteins. Here we demonstrate that disruption of cell envelope protein homeostasis simultaneously compromises several classes of resistance determinants. In particular, we find that impairing DsbA-mediated disulfide bond formation incapacitates diverse β-lactamases and destabilizes mobile colistin resistance enzymes. Furthermore, we show that chemical inhibition of DsbA sensitizes multidrug-resistant clinical isolates to existing antibiotics and that the absence of DsbA, in combination with antibiotic treatment, substantially increases the survival of Galleria mellonella larvae infected with multidrug- resistant Pseudomonas aeruginosa . This work lays the foundation for the development of novel antibiotic adjuvants that function as broad-acting resistance breakers. IMPACT STATEMENT Disruption of disulfide bond formation sensitizes resistant Gram- negative bacteria expressing β-lactamases and mobile colistin resistance enzymes to currently available antibiotics.

Abstract It is becoming increasingly apparent that commensal skin bacteria have an important role in wound healing and infection progression. However, the precise mechanisms underpinning many of these probiotic interactions remain to be fully uncovered. In this work, we demonstrate that the common skin commensal Cutibacterium acnes can limit the pathogenicity of the prevalent wound pathogen Pseudomonas aeruginosa in vivo. We show that this impact on pathogenicity is independent of any effect on growth, but occurs through a significant downregulation of the Type Three Secretion System (T3SS), the primary toxin secretion system utilised by P. aeruginosa in eukaryotic infection. We also show a downregulation in glucose acquisition systems, a known regulator of the T3SS, suggesting that glucose availability in a wound can influence infection progression. C. acnes is well known as a glucose fermenting organism, and we demonstrate that topically supplementing a wound with glucose reverses the probiotic effects of C. acnes . This suggests that introducing carbon source competition within the wound microenvironment may be an effective way to prevent or limit wound infection.

Acinetobacter baumannii is an opportunistic nosocomial pathogen with high morbidity and mortality rates. Current treatment options for this pathogen are limited due to its increasing resistance to last-resort antibiotics. Despite A . baumannii’s leading position in the World Health Organisations priority pathogens list, little is known about its virulence regulation. Through a high-throughput screening approach to identify novel biofilm regulators, we identified a previously uncharacterised predicted adenylate cyclase (AC), CavA, as a central regulator of this phenotype. cAMP is a crucial mediator of various aspects of bacterial physiology in other species but information about its role in A . baumannii is limited. We confirm that CavA AC is functional and synthesizes cAMP in A . baumannii . Using dRNA-seq, we verify that CavA is a negative biofilm formation regulator affecting Csu pili and exopolysaccharide production. We demonstrate for the first time that in A . baumannii , cAMP is atop of a hierarchical signalling cascade controlling inter- and intrabacterial signalling by modulating quorum sensing and cyclic di-GMP systems, ultimately governing virulence in vivo and adaptive antibiotic resistance. In contrast to the well-established paradigm in other bacteria where cAMP and cyclic di-GMP levels are inversely regulated, we uncover that the levels of these second messengers are directly proportional in A . baumannii . Overall, this study uncovers the central role of CavA and cAMP in the pathogenic success of A . baumannii and highlights this signalling cascade as a high potential target for novel therapeutic development.