Abstract Acral burning pain triggered by fever, thermal hyposensitivity, and skin denervation are hallmarks of small fibre neuropathy in Fabry disease, a life-threatening X-linked lysosomal storage disorder. Variants in the gene encoding alpha-galactosidase A may lead to impaired enzyme activity with cellular accumulation of globotriaosylceramide (Gb3). To study the underlying pathomechanism of Fabry-associated small fibre neuropathy, we generated a neuronal in vitro disease model using patient-derived induced pluripotent stem cells from three Fabry patients and one healthy control. We further generated an isogenic control line via CRISPR/Cas9 gene editing. We subjected iPSC to targeted peripheral neuronal differentiation and observed intra-lysosomal Gb3 accumulations in somas and neurites of Fabry sensory neurons using super-resolution microscopy. At functional level, patch-clamp analysis revealed a hyperpolarizing shift of voltage-gated sodium channel steady-state inactivation kinetics in Fabry cell lines as compared to the healthy control. Moreover, we demonstrate a drastic increase in Fabry sensory neuron Ca 2+ levels at 39°C mimicking clinical fever (p < 0.001). This pathophysiological phenotype was accompanied by thinning of neurite calibres in sensory neurons obtained from Fabry patients compared to healthy control cells (p < 0.001). Linear-Nonlinear cascade models fit to spiking responses revealed that Fabry cell lines exhibit altered single neuron encoding properties relative to control. We further observed jam of mitochondrial trafficking at sphingolipid accumulations within Fabry sensory neurites utilizing a click-chemistry approach together with mitochondrial dysmorphism compared to healthy control cells. We pioneer insights into the cellular mechanisms contributing to pain, thermal hyposensitivity, and denervation in Fabry small fibre neuropathy, and pave the way for further mechanistic in vitro studies in Fabry disease and the development of novel treatment approaches.

Abstract Introduction Reprogramming of human induced pluripotent stem cells (iPSC) and their differentiation into specific cell types, such as induced sensory-like neurons (iSN), are critical for disease modeling and drug testing. However, the variability of cell populations challenges reliability and reproducibility. While various protocols for iSN differentiation exist, development of non-iSN cells in these cultures remains an issue. Therefore, standardization of protocols is essential. This study aimed to improve iSN culture conditions by reducing the number of non-iSN cells while preserving survival and quality of iSN. Methods iSN were differentiated from a healthy control iPSC line using an established protocol. Interventions for protocol optimization included floxuridine (FdU) or 1-β-D-arabinofuranosyl-cytosin-hydrochlorid (AraC) treatment, Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), early cell passaging, and replating. Cell viability and iSN-to-total-cell-count ratio were assessed using a luminescent assay and immunocytochemistry, respectively. Results Passaging of cells during differentiation did not increase the iSN-to-total-cell-count ratio, and MACS of immature iSN led to neuronal blebbing and reduced the iSN-to-total-cell-count ratio. Treatment with high concentrations and prolonged incubation of FdU or AraC resulted in excessive cell death. However, treatment with 10 μM FdU for 24 h post-differentiation showed the most selective targeting of non-iSN cells, leading to an increase in the iSN-to-total-cell count ratio without compromising the viability or functionality of the iSN population. Replating of iSN shortly after seeding also helped to reduce non-iSN cells. Conclusion In direct comparison to other methods, treatment with 10 μM FdU for 24 h after differentiation represents a promising approach to improve iSN culture purity, offering a potential benefit for downstream applications in disease modeling and drug discovery. However, further investigations involving multiple iPSC lines and optimization of protocol parameters are warranted to fully exploit the potential of this method and enhance its reproducibility and applicability. Overall, this study provides valuable insights into optimizing culture conditions for iSN differentiation and highlights the importance of standardized protocols in iPSC-based research.