Abstract Background Radiotherapy of head and neck cancer may cause detrimental late side effects such as fibrosis and hyposalivation. Our aim was to investigate late radiation-induced cellular and molecular changes of the salivary glands after fractionated irradiation to the head and neck in a murine model. Methods 12-week-old female C57BL/6J mice were irradiated with X-rays to a total dose of 66 Gy, given in 10 fractions over 5 days. The radiation field covered the oral cavity and major salivary glands. Salivary gland function was assessed by collecting saliva at baseline and at various time points after irradiation. The submandibular (SMG), sublingual (SLG), and parotid glands (PG) were dissected at day 105. Using different staining techniques, morphological, cellular, and molecular changes were investigated in the salivary glands. Results Saliva production was significantly reduced in irradiated compared to control mice at day 35, 80, and 105. We observed a significant decrease in total gland area and a significant increase in fibrotic area in irradiated compared to control SMG at day 105. Atrophy of acinar cells was observed in all irradiated SMG and SLG. Increased amount of chronic inflammatory cells, increased cell proliferation and altered expression of apoptotic markers were found in atrophic areas of irradiated glands. Conclusion Acinar and duct cells in irradiated salivary glands show increased cell proliferation and altered expression of apoptotic markers, proposing an attempt to overcome or withstand tissue damage caused by irradiation. This suggests a potential for regeneration of salivary glands after radiation therapy.

Abstract Radiotherapy of head and neck cancer is known to cause both early and late-occurring toxicities. To better appraise normal tissue responses and their dependence on treatment parameters such as radiation field and type, as well as dose and fractionation scheme, a preclinical model with relevant endpoints is required. 12-week old female C57BL/6J mice were irradiated with 100 or 180 kV X-rays to total doses ranging from 30 to 85 Gy, given in 10 fractions over 5 days. The radiation field covered the oral cavity, swallowing structures, and salivary glands. Monte Carlo simulations were employed to estimate tissue dose distribution. The follow-up period was 35 days, in order to study the early radiation-induced effects. Baseline and post irradiation investigations included macroscopic and microscopic examinations of the skin, lips, salivary glands, and oral mucosa. Saliva sampling was performed to assess the salivary gland function following radiation exposure. A dose dependent radiation dermatitis in the skin was observed for doses above 30 Gy. Oral mucositis in the tongue appeared as ulcerations on the ventral surface of the tongue for doses of 75-85 Gy. The irradiated mice showed significantly reduced saliva production compared to controls. In summary, a preclinical model to investigate a broad panel of normal tissue responses following fractionated irradiation of the head and neck region was established. The optimal dose to study early radiation-induced effects was found to be around 75 Gy, as this was the highest tolerated dose that gave acute effects similar to what is observed in cancer patients.

Abstract Background and purpose Interferon signaling plays an important role in antitumor immune responses. Inhibitors of the DNA damage response, such as ATR inhibitors, can increase interferon signaling upon conventional radiotherapy with X-rays. However, whether such inhibitors also increase interferon (IFN) signaling after high linear energy transfer (LET) particle irradiation is not known. Materials and methods Human glioblastoma U-251 and T98G cells were treated with X-rays, protons (linear energy transfer (LET): 7 and 38 keV/μm) and carbon ions (LET: 28 and 73 keV/μm), with and without ATR inhibitor (VE822) or ATM inhibitor (AZD1390). DNA damage signaling and cell cycle distribution were assayed by immunoblotting and flow cytometry, and radiosensitivity by clonogenic survival. IFN-β secretion was measured by ELISA and STAT1 activation by immunoblotting. Results High-LET protons and carbon ions caused stronger activation of the DNA damage response compared to low-LET protons andX-rays at similar radiation dose. G2 checkpoint arrest was abrogated by the ATR inhibitor and prolonged by the ATM inhibitor after all radiation types. The inhibitors increased radiosensitivity, as measured after X- and carbon-ion-irradiation. ATR inhibition increased IFN signaling after both low-LET and high-LET irradiation in both cell lines. In T98G, IFN signaling was also enhanced by ATM inhibition. Notably, T98G cells secreted markedly more IFN-β when the inhibitors were combined with high-LET compared to low-LET irradiation. Conclusion Our results show that ATR inhibition can increase IFN signaling after both X-, proton- and carbon-ion-irradiation. Additionally, IFN induction is strongly dependent on LET in one of the tested cell lines.

Abstract Background and purpose Combining radiation therapy with immunotherapy may be beneficial in treatment of head and neck cancer (HNC), but the combined effect may depend on tumor characteristics and the type of radiation. The purpose was to compare responses for two syngeneic tumor models in mice following X-ray or proton irradiation with or without immune checkpoint inhibition (ICI). Materials and methods MOC1 and MOC2 tumors were inoculated in the right hind leg of each mouse (C57BL/6J, n=159). Single-dose irradiation with X-rays or protons and administration of anti-PDL1 started when the tumors reached 200 mm 3 . Doses of 5-30 Gy were given. Time-dependent tumor volume data were analyzed with a regression model yielding the growth rate γ without irradiation and the reduction in growth rate per dose η. Relative biological effectiveness (RBE) was calculated as the ratio of η for X-rays to that of protons. Synergy between radiation and ICI was estimated as the ratio of η’s. Results MOC2 tumors grew faster and were more radioresistant than MOC1 tumors. ICI reduced the growth rate for MOC1 with 20±2% compared to controls, while no reduction was seen for MOC2. RBE for MOC1 wo/w ICI was 0.89±0.04 and 0.93±0.06, respectively, while it was 1.15±0.12 and 1.60±0.17, respectively, for MOC2. Combination synergy for X-rays was 1.22±0.08 and 0.96±0.11 in MOC1 and MOC2, respectively, while was it 1.27±0.06 and 1.33 ±0.13, respectively, for protons. Conclusions RBE for protons was dependent on use of ICI and tumor type. A greater synergy may be achieved when combining protons with ICI compared to X-rays and ICI.

Target volumes for radiotherapy are usually contoured manually, which can be time-consuming and prone to inter- and intra-observer variability. Automatic contouring by convolutional neural networks (CNN) can be fast and consistent but may produce unrealistic contours or miss relevant structures. We evaluate approaches for increasing the quality and assessing the uncertainty of CNN-generated contours of head and neck cancers with PET/CT as input.  Approach. Two patient cohorts with head and neck squamous cell carcinoma and baseline 18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography and computed tomography images (FDG-PET/CT) were collected retrospectively from two centers. The union of manual contours of the gross primary tumor and involved nodes was used to train CNN models for generating automatic contours. The impact of image preprocessing, image augmentation, transfer learning and CNN complexity, architecture, and dimension (2D or 3D) on model performance and generalizability across centers was evaluated. A Monte Carlo dropout technique was used to quantify and visualize the uncertainty of the automatic contours.  Main results. CNN models provided contours with good overlap with the manually contoured ground truth (median Dice Similarity Coefficient: 0.75 - 0.77), consistent with reported inter-observer variations and previous auto-contouring studies. Image augmentation and model dimension, rather than model complexity, architecture, or advanced image preprocessing, had the largest impact on model performance and cross-center generalizability. Transfer learning on a limited number of patients from a separate center increased model generalizability without decreasing model performance on the original training cohort. High model uncertainty was associated with false positive and false negative voxels as well as low Dice coefficients. Significance. High quality automatic contours can be obtained using deep learning architectures that are not overly complex. Uncertainty estimation of the predicted contours shows potential for highlighting regions of the contour requiring manual revision or flagging segmentations requiring manual inspection and intervention. .

Purpose: Toxicities from head and neck (H&N) radiotherapy (RT) may affect patient quality of life and can be dose-limiting. Proteins from the transforming growth factor beta (TGF-B) family are key players in the fibrotic response. While TGF-B1 is known to be pro-fibrotic, TGF-B3 has mainly been considered anti-fibrotic. Moreover, TGF-B3 has been shown to act protective against acute toxicities after radio- and chemotherapy. In the present study, we investigated the effect of TGF-B3 treatment during fractionated H&N RT in a mouse model. Materials and methods: 30 C57BL/6J mice were assigned to three treatment groups. The RT + TGF-B3 group received local fractionated H&N RT with 66 Gy over five days, combined with TGF-B3-injections at 24-hour intervals. Animals in the RT reference group received identical RT without TGF-B3 treatment. The non-irradiated control group was sham-irradiated according to the same RT schedule. In the follow-up period, body weight and symptoms of oral mucositis and lip dermatitis were monitored. Saliva was sampled at five time points. The experiment was terminated 105 days after the first RT fraction. Submandibular and sublingual glands were preserved, sectioned, and stained with Massons trichrome to visualize collagen. Results: A subset of mice in the RT + TGF-B3 group displayed increased severity of oral mucositis and increased weight loss, resulting in a significant increase in mortality. Collagen content was significantly increased in the submandibular and sublingual glands for the surviving RT + TGF-β3 mice, compared with non-irradiated controls. In the RT reference group, collagen content was significantly increased in the submandibular gland only. Both RT groups displayed lower saliva production after treatment compared to controls. TGF-B3 treatment did not impact saliva production. Conclusions: When repeatedly administered during fractionated RT at the current dose, TGF-B3 treatment increased acute H&N radiation toxicities and increased mortality. Furthermore, TGF-B3 treatment may increase the severity of radiation-induced salivary gland fibrosis.

Abstract Purpose The introduction of immunotherapy in pleural mesothelioma (PM) has highlighted the need for effective outcome predictors. This study explores the role of [18F]FDG PET/CT in predicting outcomes in PM treated with immunotherapy. Methods Patients from the NIPU trial, receiving ipilimumab and nivolumab +/- telomerase vaccine in second-line, were included. [18F]FDG PET/CT was obtained at baseline (n = 100) and at week-5 (n = 76). Metabolic tumour volume (MTV) and peak standardised uptake value (SUV peak ) were evaluated in relation to survival outcomes. Wilcoxon rank-sum test was used to assess differences in MTV, total lesion glycolysis (TLG), maximum standardised uptake value (SUV max ) and SUV peak between patients exhibiting an objective response, defined as either partial response or complete response according to the modified Response Criteria in Solid Tumours (mRECIST) and immune RECIST (iRECIST), and non-responders, defined as either stable disease or progressive disease as their best overall response. Results Univariate Cox regression revealed significant associations of MTV with OS (HR 1.36, CI: 1.14, 1.62, p < 0.001) and PFS (HR 1.18, CI: 1.03, 1.34, p = 0.02), while multivariate analysis showed a significant association with OS only (HR 1.35, CI: 1.09, 1.68, p = 0.007). While SUV peak was not significantly associated with OS or PFS in univariate analyses, it was significantly associated with OS in multivariate analysis (HR 0.43, CI: 0.23, 0.80, p = 0.008). Objective responders had significant reductions in TLG, SUV max and SUV peak at week-5. Conclusion MTV provides prognostic value in PM treated with immunotherapy. High SUV peak was not associated with inferior outcomes, which could be attributed to the distinct mechanisms of immunotherapy. Early reductions in PET metrics correlated with treatment response. Study registration The NIPU trial (NCT04300244) is registered at clinicaltrials.gov. https://classic.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04300244?cond=Pleural+Mesothelioma&cntry=NO&draw=2&rank=4