Recent clinical successes of cancer immunotherapy necessitate the investigation of the interaction between malignant cells and the host immune system. However, elucidation of complex tumor-immune interactions presents major computational and experimental challenges. Here, we present Tumor Immune Estimation Resource (TIMER; cistrome.shinyapps.io/timer) to comprehensively investigate molecular characterization of tumor-immune interactions. Levels of six tumor-infiltrating immune subsets are precalculated for 10,897 tumors from 32 cancer types. TIMER provides 6 major analytic modules that allow users to interactively explore the associations between immune infiltrates and a wide spectrum of factors, including gene expression, clinical outcomes, somatic mutations, and somatic copy number alterations. TIMER provides a user-friendly web interface for dynamic analysis and visualization of these associations, which will be of broad utilities to cancer researchers. Cancer Res; 77(21); e108-10. ©2017 AACR.

Genome-wide screening using CRISPR coupled with nuclease Cas9 (CRISPR–Cas9) is a powerful technology for the systematic evaluation of gene function. Statistically principled analysis is needed for the accurate identification of gene hits and associated pathways. Here, we describe how to perform computational analysis of CRISPR screens using the MAGeCKFlute pipeline. MAGeCKFlute combines the MAGeCK and MAGeCK-VISPR algorithms and incorporates additional downstream analysis functionalities. MAGeCKFlute is distinguished from other currently available tools by its comprehensive pipeline, which contains a series of functions for analyzing CRISPR screen data. This protocol explains how to use MAGeCKFlute to perform quality control (QC), normalization, batch effect removal, copy-number bias correction, gene hit identification and downstream functional enrichment analysis for CRISPR screens. We also describe gene identification and data analysis in CRISPR screens involving drug treatment. Completing the entire MAGeCKFlute pipeline requires ~3 h on a desktop computer running Linux or Mac OS with R support. MAGeCKFlute is an algorithm for the analysis and visualization of CRISPR screen data. Starting from sequencing reads and an sgRNA library, the algorithm normalizes results and represents them as pathway enrichment classifications.

Abstract Organoids have been widely used for studying tissue growth and modeling diseases, but achieving physiologically relevant architecture, size, and function has remained a challenge. Here, we develop a next-generation organotypic culture method that enables the formation of a highly patterned, complex, branched tissue that is spatially organized to accurately recapitulate the morphology, scale, cellular, transcriptional, and tissue-level heterogeneity of human breast tissue. Hormone responsiveness of organoids is also a feature allowing for examination of androgen therapy or post-menopausal changes to breast tissue development and regeneration. Live imaging allows for studying stem cell dynamics during organoid formation and is adaptable to a high throughput setting. Real-time imaging of organoid formation reveals activation of latent epithelial organogenesis programs and inductive cellular dynamics that drive formation of a miniature breast tissue along with its mesenchyme akin to tissue stroma. By advancing human breast organoid technology, this model can elucidate cell- and tissue-level consequences to hormonal changes and therapy. In addition, this method can lead to new insights into the cellular, molecular, and tissue-level processes involved in organogenesis and regeneration, as well as disease.

BRAF is a serine-threonine kinase that harbors activating mutations in ~7% of human malignancies and ~60% of melanomas. Despite initial clinical responses to BRAF inhibitors (BRAFi), patients frequently develop drug resistance. To identify candidate therapeutic targets for BRAFi-resistant melanoma, we conducted CRISPR screens in melanoma cells harboring an activating BRAF mutation that had also acquired resistance to BRAFi. The screens identified pathways and genes critical for BRAFi resistance in melanoma cells. To investigate the mechanisms and pathways enabling resistance to BRAFi in melanomas, we integrated expression data, ATAC-seq, and CRISPR screen results. We identified the JUN family of transcription factors and the ETS family transcription factor ETV5 as key regulators of CDK6 that enabled resistance to BRAFi in melanoma cells. Our findings reveal genes whose loss of function conferred resistance to a selective BRAF inhibitor, providing new insight into signaling pathways that contribute to acquired resistance in melanoma.

Abstract Fibroblasts are a major cell type within breast microenvironment which play key roles in tissue remodeling during the processes of normal development, injury, and malignancy. During wound healing and tumorigenesis, fibroblasts facilitate production and degradation of the extracellular matrix and produce inflammatory mediators which act as immune regulators. Domain Discoidin Receptor 1 (DDR1) is a cell surface tyrosine kinase receptor expressed by epithelial and stromal cells which is activated by collagen. In the breast, DDR1 expression and activity has been implicated in the development of fibrosis as well as chemotherapy resistance. We set out to examine whether selective inhibition of DDR1 would modulate fibroblast immunomodulatory function to generate an immune-permissive breast microenvironment and reduce stromal desmoplasia. In vivo, DDR1 inhibition resulted in mammary fibroblast tissue remodeling, reduced collagen deposition, and changes in immunomodulatory cytokine expression. Furthermore, DDR1 inhibition was associated with increased CD45.2+ immune cell infiltration and reduced Ly6G+/Ly6C− neutrophil infiltration. Mechanistically, we developed an ex-vivo 3D collagen hydrogel model of desmoplasia to study the effects of DDR1 inhibition on the expression of immune modulating factors and fibroblast functions and features. We found that DDR1 regulates the expression and secretion of key immunomodulatory cytokines (IL-6, IL-8, and MCP-1). Collectively these findings suggest that breast fibroblast-specific DDR1 mediates collagen deposition and immunomodulatory function within the mammary gland and warrants further investigation as a potential target for fibroblast-modulating therapy in benign and neoplastic breast disorders.

Abstract The human breast is complex and comprised of multi-lineage and multi-structural elements. Recent work has shown that epithelial stem and progenitor cells use the collagen receptor Discoidin Domain Receptor 1 (DDR1) for differentiation into both basal and luminal cell lineages, which together are necessary for both ductal and alveolar morphogenesis. We developed a next-generation single cell derived organoid model that generates miniaturized breast tissue, to study how single stem cells can give rise to multiple cell types and compound tissue structures. We show that DDR1 activation triggers stem cell differentiation via RUNX1 in turn driving multilineage differentiation as well as complex ductal-lobular development. Mechanistically, DDR1 affects the interaction and expression of RUNX1 and its cofactor CBFβ thereby regulating its activity. Together, these findings contribute to the current understanding of how the extracellular matrix component within the stem cell niche drives organogenesis and tissue regeneration.