Proximity labeling proteomics (PLP) strategies are powerful approaches to yield snapshots of protein neighborhoods. Here, we describe a multiscale PLP method with adjustable resolution that uses a commercially available photocatalyst, Eosin Y, which upon visible light illumination activates different photo-probes with a range of labeling radii. We applied this platform to profile neighborhoods of the oncogenic epidermal growth factor receptor and orthogonally validated more than 20 neighbors using immunoassays and AlphaFold-Multimer prediction. We further profiled the protein neighborhoods of cell-cell synapses induced by bispecific T cell engagers and chimeric antigen receptor T cells. This integrated multiscale PLP platform maps local and distal protein networks on and between cell surfaces, which will aid in the systematic construction of the cell surface interactome, revealing horizontal signaling partners and reveal new immunotherapeutic opportunities.

The cell membrane proteome is the primary biohub for cell communication, yet we are only beginning to understand the dynamic protein neighborhoods that form on the cell surface and between cells. Proximity labeling proteomics (PLP) strategies using chemically reactive probes are powerful approaches to yield snapshots of protein neighborhoods but are currently limited to one single resolution based on the probe labeling radius. Here, we describe a multi-scale PLP method with tunable resolution using a commercially available histological dye, Eosin Y, which upon visible light illumination, activates three different photo-probes with labeling radii ranging from ∼100 to 3000 Å. We applied this platform to profile neighborhoods of the oncogenic epidermal growth factor receptor (EGFR) and orthogonally validated >20 neighbors using immuno-assays and AlphaFold-Multimer prediction that generated plausible binary interaction models. We further profiled the protein neighborhoods of cell-cell synapses induced by bi-specific T-cell engagers (BiTEs) and chimeric antigen receptor (CAR)T cells at longer length scales. This integrated multi-scale PLP platform maps local and distal protein networks on cell surfaces and between cells. We believe this information will aid in the systematic construction of the cell surface interactome and reveal new opportunities for immunotherapeutics.

Engineered luciferases and luciferins have dramatically expanded the scope of bioluminescence imaging in recent years. Multicomponent tracking remains challenging, though, due to a lack of streamlined methods to visualize combinations of bioluminescent reporters. Here we report a strategy for rapid, multiplexed imaging with a wide range of luciferases and luciferins. Sequential addition of orthogonal luciferins, followed by substrate unmixing, enabled facile detection of multiple luciferases in vitro and in vivo. Multicomponent imaging in mice was also achieved on the minutes-to-hours time scale, a vast improvement over conventional protocols.