ABSTRACT Metabarcoding analysis of environmental DNA samples is a promising new tool for marine biodiversity and conservation. Typically, seawater samples are obtained using Niskin bottles and filtered to collect eDNA. However, standard sample volumes are small relative to the scale of the environment, conventional collection strategies are limited, and the filtration process is time consuming. To overcome these limitations, we developed a new large – volume eDNA sampler with in situ filtration, capable of taking up to 12 samples per deployment. We conducted three deployments of our sampler on the robotic vehicle Mesobot in the Flower Garden Banks National Marine Sanctuary in the northwestern Gulf of Mexico and collected samples from 20 to 400 m depth. We compared the large volume (∼40 – 60 liters) samples collected by Mesobot with small volume (∼2 liters) samples collected using the conventional CTD – mounted Niskin bottle approach. We sequenced the V9 region of 18S rRNA, which detects a broad range of invertebrate taxa, and found that while both methods detected biodiversity changes associated with depth, our large volume samples detected approximately 66% more taxa than the CTD small volume samples. We found that the fraction of the eDNA signal originating from metazoans relative to the total eDNA signal decreased with sampling depth, indicating that larger volume samples may be especially important for detecting metazoans in mesopelagic and deep ocean environments. We also noted substantial variability in biological replicates from both the large volume Mesobot and small volume CTD sample sets. Both of the sample sets also identified taxa that the other did not – although the number of unique taxa associated with the Mesobot samples was almost four times larger than those from the CTD samples. Large volume eDNA sampling with in situ filtration, particularly when coupled with robotic platforms, has great potential for marine biodiversity surveys, and we discuss practical methodological and sampling considerations for future applications.

Abstract The distributions of anthozoan corals are under-characterized due to their wide bathymetric range, occurrences in remote locales, and difficulties of identification from morphology alone. Environmental DNA (eDNA) sequencing promises to be a non-invasive strategy to complement conventional approaches for mapping and monitoring coral communities. Primers for eDNA meta-barcoding have been designed to amplify nuclear and mitochondrial DNA barcodes in shallow scleractinians and mitochondrial MutS in deep-sea octocorals. However, a comprehensive method for eDNA meta-barcoding from all anthozoan corals, including black corals, has not been developed. We leveraged a sequence database of global coral collections, from shallow water to the deep sea, to design new PCR primers for coral eDNA sequencing that target the 28S rRNA gene. We tested the performance of these primers by amplifying and sequencing eDNA from water samples collected in the Gulf of Mexico near mesophotic and deep-sea corals that were also imaged, sampled, and sequenced. Sequencing libraries produced using the primers were highly enriched in coral eDNA, with up to 99.8% of the reads originating from corals. Further, the 28S barcode amplified using the primers distinguished coral genera. We recovered amplicon sequencing variants (ASVs) identical to DNA barcodes derived from Sanger sequencing and genome skimming of corals sampled at the same field sites. This new eDNA meta-barcoding strategy permits targeted eDNA sequencing of black corals, octocorals, and scleractinians at sites where they co-occur and expands our current toolkit for mapping and monitoring coral communities in shallow coral reefs and the deep sea.

1: Numerous genomic methods developed over the past two decades have enabled the discovery and extraction of orthologous loci to help resolve phylogenetic relationships across various taxa and scales. Genome skimming (or low-coverage whole genome sequencing) remains a low-cost, promising method to not only extract high-copy loci, but also 100s to 1000s of phylogenetically informative single-copy nuclear loci (e.g., ultraconserved elements [UCEs] and exons) from contemporary and historical museum samples. The subphylum Anthozoa, which includes important ecosystem engineers (e.g., stony corals, black corals, anemones and octocorals) in the marine environment, is in critical need of phylogenetic resolution and thus might benefit from a genome-skimming approach. 2: Genome skimming was conducted on 242 hexacorals and octocorals collected from 1890 to 2022. Using previously developed target-capture baitsets, we bioinformatically obtained UCEs and exons from the genome-skimming data and incorporated them with data from previously published target-capture studies. We also extracted partial to whole mitogenomes and nuclear rRNA genes from the skim data. 3: The mean number of UCE and exon loci extracted from the genome skimming data was 1,837 ± 662 SD for octocorals and 1,422 ± 720 loci for hexacorals; phylogenetic relationships were well resolved within each class. A mean of 1,422 ± 720 loci were obtained from the historical museum specimens, with 1,253 loci recovered from the oldest specimen collected in 1886 and 1,336 loci recovered from a holotype. The nuclear rRNA genes and the majority of mitochondrial genes were successfully obtained from >95% of samples. Out of 99 circularized mitogenomes, 88% were recovered in samples from which we obtained >15M paired-end (PE) reads (>30M total reads); there was more variability in whether mitogenomes were circularized or not in samples with <15M PE reads. 4: Bioinformatically pulling UCEs, exons, mitochondrial genomes, and nuclear rRNA genes from genome skimming is a viable and low-cost option for phylogenetic studies. This approach can be used to review and support taxonomic revisions and reconstruct evolutionary histories, including historical museum and type specimens.

Accurately constraining the transport of environmental DNA (eDNA) after it is shed from an animal is vital to appropriately geolocate species detections and biodiversity measurements from eDNA sequencing data. Modeling studies predict the horizontal transport of eDNA at concentrations detectable using quantitative PCR over scales of tens of kilometers, but more limited vertical transport. Field studies routinely find that eDNA metabarcoding data distinguishes biological communities at small spatial scales, over scales of tens of meters. Here, we leverage the unique bathymetry of an offshore, mesophotic bank and the benthic invertebrate community that it supports to determine the extent to which vertical and horizontal eDNA transport may affect the interpretation of species detections from eDNA metabarcoding data. We found that in a stratified water column, eDNA from benthic invertebrates was vertically constrained to depths close to the seafloor in the thermocline versus in the surface mixed layer above. However, when using primers that are taxonomically specific to corals, we found evidence for the horizontal transport of coral eDNA at distances at least ~1.5 km from where they can be reasonably expected to occur. On the contrary, there was minimal evidence for horizontal transport of benthic eDNA in data generated using primers that broadly targeted sequences from eukaryotes. These results highlight the importance of horizontal transport as well as considering methodological details, like the taxonomic specificity of PCR primers, when interpreting eDNA sequencing data.