Abstract Cystic fibrosis is most frequently caused by the deletion of F508 (ΔF508) in CFTR’s nucleotide binding domain 1 (NBD1), compromising CFTR folding, stability and domain assembly. The limitation of developing a successful therapy is due to the lack of molecules that synergistically facilitate folding by targeting distinct structural defects of ΔF508-CFTR. To improve drug efficacy by targeting the ΔF508-NBD1 folding and stability, and to study potential ΔF508-NBD1 allosteric corrector binding sites at the atomic level, we combined molecular dynamics (MD) simulations, atomic force spectroscopy (AFM) and hydrogen-deuterium exchange (HDX) experiments. These methods allowed us to describe unfolding intermediates and forces acting during NBD1 mechanical unfolding and to elucidate the stabilization mechanism of ΔF508-NBD1 by 5-bromoindole-3-acetic acid (BIA). An NBD1 region, including the α-subdomain, was identified as a potentially important participant of the first folding steps, characterized by non-native interactions of F508, thus destabilized in the deletion mutant. The instability was counteracted by the low-potency corrector BIA, increasing the mechanical resistance of the ΔF508-NBD1 α-subdomain, which was confirmed as a binding site by computational modeling and HDX experiments. Our results underline the complementarity of computational and experimental methods and provide a possible strategy to improve folding correctors.

Abstract The clinical management of severe COVID-19 cases is not yet well resolved. Therefore, it is important to identify and characterize cell signaling pathways involved in virus pathogenesis that can be targeted therapeutically. Envelope (E) protein is a structural protein of the virus, which is known to be highly expressed in the infected host cell and is a key virulence factor, however, its role is poorly characterized. The E protein is a single-pass transmembrane protein that can assemble into a pentamer forming a viroporin, perturbing Ca 2+ homeostasis. Because it is structurally similar to regulins such as, for example, phospholamban, that regulate the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPases (SERCA), we investigated whether the SARS-CoV-2 E protein affects the SERCA system as an exoregulin. Using FRET experiments we demonstrate that E protein can form oligomers with regulins, and thus can alter the monomer/multimer regulin ratio and consequently influence their interactions with SERCAs. We also confirmed that a direct interaction between E protein and SERCA2b results in a decrease in SERCA-mediated ER Ca 2+ reload. Structural modeling and molecular dynamics of the complexes indicates an overlapping interaction site for E protein and endogenous regulins. Our results reveal novel links in the host-virus interaction network that play an important role in viral pathogenesis and may provide a new therapeutic target for managing severe inflammatory responses induced by SARS-CoV-2.

Single amino acid substitutions can profoundly affect protein folding, dynamics, and function, leading to potential pathological consequences. The ability to discern between benign and pathogenic substitutions is pivotal for therapeutic interventions and research directions. Given the limitations in experimental examination of these variants, AlphaMissense has emerged as a promising predictor of the pathogenicity of single nucleotide polymorphism variants. In our study, we assessed the efficacy of AlphaMissense across several protein groups, such as mitochondrial, housekeeping, transmembrane proteins, and specific proteins like CFTR, using ClinVar data for validation. Our comprehensive evaluation showed that AlphaMissense delivers outstanding performance, with MCC scores predominantly between 0.6 and 0.74. We observed low performance on the CFTR and disordered, membrane-interacting MemMoRF datasets. However, an enhanced performance with CFTR was shown when benchmarked against the CFTR2 database. Our results also emphasize that quality of AlphaFold9s predictions can seriously influence AlphaMissense predictions. Most importantly, AlphaMissense9s consistent capability in predicting pathogenicity across diverse protein groups, spanning both transmembrane and soluble domains was found. Moreover, the prediction of likely-pathogenic labels for IBS and CFTR coupling helix residues emphasizes AlphaMissense9s potential as a tool for pinpointing functionally significant sites. Additionally, to make AlphaMissense predictions more accessible, we have introduced a user-friendly web resource (https://alphamissense.hegelab.org) to enhance the utility of this valuable tool. Our insights into AlphaMissense9s capability, along with this online resource, underscore its potential to significantly aid both research and clinical applications.

Abstract Loss of epithelial cell polarity and tissue disorganization are hallmarks of carcinogenesis, in which Ca 2+ signaling plays a significant role. Here we demonstrate that the plasma membrane Ca 2+ pump PMCA4 (ATP2B4) is downregulated in luminal breast cancer, and this is associated with shorter relapse-free survival in patients with luminal A and B1 subtype tumors. Using the MCF-7 breast cancer cell model we show that PMCA4 silencing results in the loss of cell polarity while a forced increase in PMCA4b expression induces cell polarization and promotes lumen formation in 2D and 3D cell cultures. We identify Arf6 as a novel regulator of PMCA4b endocytic recycling essential for PMCA4 regulated lumen formation. Silencing of the single pmca gene in Drosophila melanogaster larval salivary gland destroys lumen morphology suggesting a conserved role of PMCAs in lumen morphogenesis. Our findings point to a novel role of PMCA4 in controlling epithelial cell polarity, and in the maintenance of normal glandular tissue architecture.