This unit is designed to provide sufficient instruction for the setup and execution of tests for object location and object recognition in adult mice. This task is ideally suited for the study of a variety of mouse models that examine disease mechanisms and novel therapeutic targets. By altering several key parameters, the experimenter can investigate short-term or long-term memory and look for either memory impairments or enhancements. Object location and object recognition memory tasks rely on a rodent's innate preference for novelty, and can be conducted sequentially in the same cohort of animals. These two tasks avoid the inherent stress induced with other common measures of rodent memory such as fear conditioning and the Morris water maze. This protocol covers detailed instructions on conducting both tasks, as well as key points concerning data collection, analysis, and interpretation.

Abstract Neurodevelopmental disorders (NDDs) impact 7% to 14% of all children in developed countries and are one of the leading causes of lifelong disability. Epigenetic modifications are poised at the interface between genes and environment and are predicted to reveal insight into the gene networks, cell types, and developmental timing of NDD etiology. Whole-genome bisulfite sequencing was used to examine DNA methylation in 49 human cortex samples from three different NDDs (autism spectrum disorder, Rett syndrome, and Dup15q syndrome) and matched controls. Integration of methylation differences across NDDs with relevant genomic and genetic datasets revealed differentially methylated regions (DMRs) unique to each type of NDD but with shared regulatory functions in neurons and microglia. DMRs were significantly enriched for known NDD genetic risk factors, including both common inherited and rare de novo variants. Weighted region co-methylation network analysis revealed a module related to NDD diagnosis and enriched for microglial regulatory regions. Together, these results demonstrate an epigenomic signature of NDDs in human cortex shared with known genetic and immune etiological risk. Epigenomic insights into cell types and gene regulatory regions will aid in defining therapeutic targets and early biomarkers at the interface of genetic and environmental NDD risk factors.

As rapid responders to their environments, microglia engage in functions that are mirrored by their cellular morphology. Microglia are classically thought to exhibit a ramified morphology under homeostatic conditions which switches to an ameboid form during inflammatory conditions. However, microglia display a wide spectrum of morphologies outside of this dichotomy, including rod-like, ramified, ameboid, and hypertrophic states, which have been observed across brain regions, neurodevelopmental timepoints, and various pathological contexts. We applied dimensionality reduction and clustering to consider contributions of multiple morphology measures together to define a spectrum of microglial morphological states in a mouse dataset that we used to demonstrate the utility of our toolset. Using ImageJ, we first developed a semiautomated approach to characterize 27 morphology features from hundreds to thousands of individual microglial cells in a brain region-specific manner. Within this pool of features, we defined distinct sets of highly correlated features that describe different aspects of morphology, including branch length, branching complexity, territory span, and circularity. When considered together, these sets of features drove different morphological clusters. Our tools captured morphological states similarly and robustly when applied to independent datasets and using different immunofluorescent markers for microglia. We have compiled our morphology analysis pipeline into an accessible, easy-to-use, and fully open-source ImageJ macro and R package that the neuroscience community can expand upon and directly apply to their own analyses. Outcomes from this work will supply the field with new tools to systematically evaluate the heterogeneity of microglia morphological states across various experimental models and research questions.

Abstract Background As the primary innate immune cells of the brain microglia respond to damage and disease through pro-inflammatory release of cytokines and neuroinflammatory molecules. Histone acetylation is an activating transcriptional mark that regulates gene expression, which is altered in states of disease. Inhibition of histone deacetylase 3 (Hdac3) has been utilized in pre-clinical models of disease to dampen inflammation, but the molecular mechanisms underlying Hdac3’s regulation of inflammatory gene expression in microglia is not well understood. Methods Functional changes in immortalized microglia were characterized using a Hdac3 specific inhibitor RGFP966 in response to an immune challenge lipopolysaccharide (LPS). Flow cytometry and cleavage under tags & release using nucleases (CUT & RUN) were used to investigate global and promoter-specific histone acetylation changes, resulting in altered gene expression. Results Hdac3 inhibition enhanced neuroprotective functions of microglia in response to LPS through reduced nitric oxide release and increased baseline phagocytosis. Inhibition of Hdac3 enhanced histone acetylation globally and at specific gene loci, resulting in the release of gene repression at baseline and enhanced responses to LPS. Conclusion The findings suggest Hdac3 serves as a negative regulator of microglial gene expression, and that inhibition of Hdac3 facilitates the microglial response to inflammation and its subsequent resolution. Together, this work provides new mechanistic insights into therapeutic applications of Hdac3 inhibition which mediate reduced neuroinflammatory insults through microglial response.

Rhythmic oscillations of physiological processes depend on integrating the circadian clock and diurnal environment. DNA methylation is epigenetically responsive to daily rhythms, as a subset of CpG dinucleotides in brain exhibit diurnal rhythmic methylation. A major genetic effect on rhythmic methylation was identified in a mouse Snord116 deletion model of the imprinted disorder Prader-Willi syndrome (PWS). Of the >23,000 diurnally rhythmic CpGs identified in wild-type cortex, 97% lost rhythmic methylation in PWS cortex. Circadian dysregulation of a second imprinted Snord cluster at the Temple/Kagami-Ogata syndrome locus was observed at the level of methylation, transcription, and chromatin, providing mechanistic evidence of cross-talk. Genes identified by diurnal epigenetic changes in PWS mice overlapped rhythmic and PWS-specific genes in human brain and were enriched for PWS-relevant obesity phenotypes and pathways. These results support the proposed evolutionary relationship between imprinting and sleep, and suggest possible chronotherapy in the treatment of PWS and related disorders.

Abstract Background Maternal care during early-life plays a crucial role in the sculpting of the mammalian brain. Augmented maternal care during the first postnatal week promotes life-long stress resilience and improved memory compared with the outcome of routine rearing conditions. Recent evidence suggests that this potent phenotypic change commences with altered synaptic connectivity of stress sensitive hypothalamic neurons. However, the epigenomic basis of the long-lived consequences is not well understood. Methods Here, we employed whole-genome bisulfite sequencing (WGBS), RNA-sequencing (RNA-seq), and a multiplex microRNA (miRNA) assay to examine the effects of augmented maternal care on DNA cytosine methylation, gene expression, and miRNA expression. Results A significant decrease in global DNA methylation was observed in offspring hypothalamus following a week of augmented maternal care, corresponding to differential methylation and expression of thousands of genes. Differentially methylated and expressed genes were enriched for functions in neurotransmission, neurodevelopment, protein synthesis, and oxidative phosphorylation, as well as known stress response genes. Twenty prioritized genes with three lines of evidence (methylation, expression, and altered miRNA target) were identified as highly relevant to the stress resiliency phenotype. Conclusions This combined unbiased approach enabled the discovery of novel genes and gene pathways that advance our understanding of the central epigenomic mechanisms underlying the profound effects of maternal care on the developing brain.

As rapid responders to their environments, microglia engage in functions that are mirrored by their cellular morphology. Microglia are classically thought to exhibit a ramified morphology under homeostatic conditions which switches to an ameboid form during inflammatory conditions. However, microglia display a wide spectrum of morphologies outside of this dichotomy, including rod-like, ramified, ameboid, and hypertrophic states, which have been observed across brain regions, neurodevelopmental timepoints, and various pathological contexts. We used dimensionality reduction and clustering approaches to consider contributions of multiple morphology measures together to define a spectrum of microglial morphological states. Using ImageJ tools, we first developed a semi-automated approach to characterize 27 morphology features from hundreds to thousands of individual microglial cells in a brain subregion-specific manner. Within this pool of morphology measures, we defined distinct sets of highly correlated features that describe different aspects of morphology, including branch length, branching complexity, territory span, and cell circularity. When considered together, these sets of features drove different morphological clusters. Furthermore, our analysis toolset captured morphological states similarly and robustly when applied to independent datasets and using different immunofluorescent markers for microglia. We have compiled our morphology analysis pipeline into an accessible, easy to use, and fully open-source ImageJ macro and R package that the neuroscience community can expand upon and directly apply to their own analyses. Outcomes from this work will supply the field with new tools to systematically evaluate the heterogeneity of microglia morphological states across various experimental models and research questions.

Abstract Background Neuroinflammation is involved in the pathogenesis of almost every central nervous system disorder. As the brain’s innate immune cells, microglia fine tune their activity to a dynamic brain environment. Previous studies have shown that repeated bouts of peripheral inflammation can trigger long-term changes in microglial gene expression and function, a form of innate immune memory. Methods and Results In this study, we used multiple low-dose lipopolysaccharide (LPS) injections in adult mice to study the acute cytokine, transcriptomic, and microglia morphological changes that contribute to the formation of immune memory in the frontal cortex, hippocampus, and striatum, as well as the long-term effects of these changes on behavior. Training and tolerance of gene expression was shared across regions, and we identified 3 unique clusters of DEGs (2xLPS-sensitive, 4xLPS-sensitive, LPS-decreased) with different biological functions. 2xLPS-sensitive DEG promoters were enriched for binding sites for IRF and NFkB family transcription factors, two key regulators of innate immune memory. We quantified shifts in microglia morphological populations and found that while the proportion of ramified and rod-like microglia mostly remained consistent within brain regions and sexes with LPS treatment, there was a shift from ameboid towards hypertrophic morphological states across immune memory states and a dynamic emergence and resolution of trains of rod-like microglia with repeated LPS. Conclusions Together, findings support the dynamic regulation of microglia during the formation of immune memories in the brain and support future work to exploit this model in brain disease contexts.

Abstract Despite recent advances in understanding the connection between the gut microbiota and the brain, there remains a wide knowledge gap in how gut inflammation impacts brain development. Microbiota-derived metabolite signaling from the gut to the brain is required for normal development of microglia, the brain’s resident immune cells. Disruption of the microbiota-brain communication has been linked to impaired behaviours and Autism Spectrum Disorder. We hypothesized that intestinal inflammation in early life would negatively affect neurodevelopment through dysregulation of microbiota communication to brain microglia. To test this hypothesis, we developed a novel pediatric model of Inflammatory Bowel Disease (IBD). IBD is an incurable condition affecting millions of people worldwide, characterized by chronic intestinal inflammation, and has comorbid symptoms of anxiety, depression and cognitive impairment. Significantly, 25% of IBD patients are diagnosed during childhood, and the effect of chronic inflammation during this critical period of development is largely unknown. We developed a chemical model of pediatric chronic IBD by repeatedly treating juvenile mice with dextran sodium sulfate (DSS) in drinking water. DSS-treated mice displayed increased intestinal inflammation, altered microbiota and changes in circulating metabolites. We also found that alterations in gut microbiota had long-term impacts on female microglia and male sex-specific behaviours and testosterone regulation, consistent with delayed puberty observed in male IBD patients. Our research expands our understanding of microbiota-microglia communication underlying development. The gut-brain axis is an exciting target for personalized medicine as microbiome manipulations could be feasible for early intervention to reverse deficits due to juvenile inflammation. Highlights Early life gut inflammation produces sex-specific i) microbiome, ii) sex hormone and iii) behavioural impacts Both sexes show disrupted gut bacterial members that regulate sex hormone levels Male mice demonstrate deficits in mate seeking, which may be mediated by reduced seminal vesicle mass and reduced androgen levels Female mice lack behavioural deficits, but demonstrate increased amoeboid microglia in the hippocampus