Identifying master regulators of biological processes and mapping their downstream gene networks are key challenges in systems biology. We developed a computational method, called iRegulon, to reverse-engineer the transcriptional regulatory network underlying a co-expressed gene set using cis-regulatory sequence analysis. iRegulon implements a genome-wide ranking-and-recovery approach to detect enriched transcription factor motifs and their optimal sets of direct targets. We increase the accuracy of network inference by using very large motif collections of up to ten thousand position weight matrices collected from various species, and linking these to candidate human TFs via a motif2TF procedure. We validate iRegulon on gene sets derived from ENCODE ChIP-seq data with increasing levels of noise, and we compare iRegulon with existing motif discovery methods. Next, we use iRegulon on more challenging types of gene lists, including microRNA target sets, protein-protein interaction networks, and genetic perturbation data. In particular, we over-activate p53 in breast cancer cells, followed by RNA-seq and ChIP-seq, and could identify an extensive up-regulated network controlled directly by p53. Similarly we map a repressive network with no indication of direct p53 regulation but rather an indirect effect via E2F and NFY. Finally, we generalize our computational framework to include regulatory tracks such as ChIP-seq data and show how motif and track discovery can be combined to map functional regulatory interactions among co-expressed genes. iRegulon is available as a Cytoscape plugin from http://iregulon.aertslab.org.

Abstract Transcriptional reprogramming of proliferative melanoma cells into a phenotypically distinct invasive cell subpopulation is a critical event at the origin of metastatic spreading. Here we generate transcriptome, open chromatin and histone modification maps of melanoma cultures; and integrate this data with existing transcriptome and DNA methylation profiles from tumour biopsies to gain insight into the mechanisms underlying this key reprogramming event. This shows thousands of genomic regulatory regions underlying the proliferative and invasive states, identifying SOX10/MITF and AP-1/TEAD as regulators, respectively. Knockdown of TEADs shows a previously unrecognized role in the invasive gene network and establishes a causative link between these transcription factors, cell invasion and sensitivity to MAPK inhibitors. Using regulatory landscapes and in silico analysis, we show that transcriptional reprogramming underlies the distinct cellular states present in melanoma. Furthermore, it reveals an essential role for the TEADs, linking it to clinically relevant mechanisms such as invasion and resistance.

Stein Aerts, Jan Cools and colleagues report exome sequencing of T-cell acute lymphoblastic leukemia. They identify recurrent somatic mutations in CNOT3 and ribosome genes RPL5 and RPL10. T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is caused by the cooperation of multiple oncogenic lesions1,2. We used exome sequencing on 67 T-ALLs to gain insight into the mutational spectrum in these leukemias. We detected protein-altering mutations in 508 genes, with an average of 8.2 mutations in pediatric and 21.0 mutations in adult T-ALL. Using stringent filtering, we predict seven new oncogenic driver genes in T-ALL. We identify CNOT3 as a tumor suppressor mutated in 7 of 89 (7.9%) adult T-ALLs, and its knockdown causes tumors in a sensitized Drosophila melanogaster model3. In addition, we identify mutations affecting the ribosomal proteins RPL5 and RPL10 in 12 of 122 (9.8%) pediatric T-ALLs, with recurrent alterations of Arg98 in RPL10. Yeast and lymphoid cells expressing the RPL10 Arg98Ser mutant showed a ribosome biogenesis defect. Our data provide insights into the mutational landscape of pediatric versus adult T-ALL and identify the ribosome as a potential oncogenic factor.

i-cisTarget is a web tool to predict regulators of a set of genomic regions, such as ChIP-seq peaks or co-regulated/similar enhancers. i-cisTarget can also be used to identify upstream regulators and their target enhancers starting from a set of co-expressed genes. Whereas the original version of i-cisTarget was focused on Drosophila data, the 2015 update also provides support for human and mouse data. i-cisTarget detects transcription factor motifs (position weight matrices) and experimental data tracks (e.g. from ENCODE, Roadmap Epigenomics) that are enriched in the input set of regions. As experimental data tracks we include transcription factor ChIP-seq data, histone modification ChIP-seq data and open chromatin data. The underlying processing method is based on a ranking-and-recovery procedure, allowing accurate determination of enrichment across heterogeneous datasets, while also discriminating direct from indirect target regions through a ‘leading edge’ analysis. We illustrate i-cisTarget on various Ewing sarcoma datasets to identify EWS-FLI1 targets starting from ChIP-seq, differential ATAC-seq, differential H3K27ac and differential gene expression data. Use of i-cisTarget is free and open to all, and there is no login requirement. Address: http://gbiomed.kuleuven.be/apps/lcb/i-cisTarget.

Abstract Melanoma is notorious for its cellular heterogeneity, which is at least partly due to its ability to transition between alternate cell states. Similarly to EMT, melanoma cells with a melanocytic phenotype can switch to a mesenchymal-like phenotype. However, scattered emerging evidence indicates that additional, intermediate state(s) may exist. In order to search for such new melanoma states and decipher their underlying gene regulatory network (GRN), we extensively studied ten patient-derived melanoma cultures by single-cell RNA-seq of >39,000 cells. Although each culture exhibited a unique transcriptome, we identified shared gene regulatory networks that underlie the extreme melanocytic and mesenchymal cell states, as well as one (stable) intermediate state. The intermediate state was corroborated by a distinct open chromatin landscape and governed by the transcription factors EGR3, NFATC2, and RXRG. Single-cell migration assays established that this “transition” state exhibits an intermediate migratory phenotype. Through a dense time-series sampling of single cells and dynamic GRN inference, we unraveled the sequential and recurrent arrangement of transcriptional programs at play during phenotype switching that ultimately lead to the mesenchymal cell state. We provide the scRNA-Seq data with 39,263 melanoma cells on our SCope platform and the ATAC-seq data on a UCSC hub to jointly serve as a resource for the melanoma field. Together, this exhaustive analysis of melanoma cell state diversity indicates that additional states exists between the two extreme melanocytic and mesenchymal-like states. The GRN we identified may serve as a new putative target to prevent the switch to mesenchymal cell state and thereby, acquisition of metastatic and drug resistant potential.

Single-cell RNA-seq allows building cell atlases of any given tissue and infer the dynamics of cellular state transitions during developmental or disease trajectories. Both the maintenance and transitions of cell states are encoded by regulatory programs in the genome sequence. However, this regulatory code has not yet been exploited to guide the identification of cellular states from single-cell RNA-seq data. Here we describe a computational resource, called SCENIC (Single Cell rEgulatory Network Inference and Clustering), for the simultaneous reconstruction of gene regulatory networks (GRNs) and the identification of stable cell states, using single-cell RNA-seq data. SCENIC outperforms existing approaches at the level of cell clustering and transcription factor identification. Importantly, we show that cell state identification based on GRNs is robust towards batch-effects and technical-biases. We applied SCENIC to a compendium of single-cell data from the mouse and human brain and demonstrate that the proper combinations of transcription factors, target genes, enhancers, and cell types can be identified. Moreover, we used SCENIC to map the cell state landscape in melanoma and identified a gene regulatory network underlying a proliferative melanoma state driven by MITF and STAT and a contrasting network controlling an invasive state governed by NFATC2 and NFIB. We further validated these predictions by showing that two transcription factors are predominantly expressed in early metastatic sentinel lymph nodes. In summary, SCENIC is the first method to analyze scRNA-seq data using a network-centric, rather than cell-centric approach. SCENIC is generic, easy to use, and flexible, and allows for the simultaneous tracing of genomic regulatory programs and the mapping of cellular identities emerging from these programs. Availability: SCENIC is available as an R workflow based on three new R/Bioconductor packages: GENIE3, RcisTarget and AUCell. As scalable alternative to GENIE3, we also provide GRNboost, paving the way towards the network analysis across millions of single cells.

The identification of functional non-coding mutations is a key challenge in the field of genomics, where whole-genome re-sequencing can swiftly generate a set of all genomic variants in a sample, such as a tumor biopsy. The size of the human regulatory landscape places a challenge on finding recurrent cis-regulatory mutations across samples of the same cancer type. Therefore, powerful computational approaches are required to sift through the tens of thousands of non-coding variants, to identify potentially functional variants that have an impact on the gene expression profile of the sample. Here we introduce an integrative analysis pipeline, called μ-cisTarget, to filter, annotate and prioritize non-coding variants based on their putative effect on the underlying ‘personal’ gene regulatory network. We first validate μ-cisTarget by re-analyzing three cases of oncogenic non-coding mutations, namely the TAL1 and LMO1 enhancer mutations in T-ALL, and the TERT promoter mutation in melanoma. Next, we re-sequenced the full genome of ten cancer cell lines of six different cancer types, and used matched transcriptome data and motif discovery to infer master regulators for each sample. We identified candidate functional non-coding mutations that generate de novo binding sites for these master regulators, and that result in the up-regulation of nearby oncogenic drivers. We finally validated the predictions using tertiary data including matched epigenome data. Our approach is generally applicable to re-sequenced cancer genomes, or other genomes, when a disease- or sample-specific gene signature is available for network inference. μ-cisTarget is available from http://mucistarget.aertslab.org.

Abstract During neuronal circuit formation, local control of axonal organelles ensures proper synaptic connectivity. Whether this process is genetically encoded is unclear and if so, its developmental regulatory mechanisms remain to be identified. We hypothesized that developmental transcription factors regulate critical parameters of organelle homeostasis that contribute to circuit wiring. We combined cell type-specific transcriptomics with a genetic screen to discover such factors. We identified Telomeric Zinc finger-Associated Protein (TZAP) as a temporal developmental regulator of neuronal mitochondrial homeostasis genes, including Pink1 . In Drosophila , loss of dTzap function during visual circuit development leads to loss of activity-dependent synaptic connectivity, that can be rescued by Pink1 expression. At the cellular level, loss of dTzap/TZAP leads to defects in mitochondrial morphology, attenuated calcium uptake and reduced synaptic vesicle release in fly and mammalian neurons. Our findings highlight developmental transcriptional regulation of mitochondrial homeostasis as a key factor in activity-dependent synaptic connectivity.