Extensive pre-mRNA back-splicing generates numerous circular RNAs (circRNAs) in human transcriptome. However, the biological functions of these circRNAs remain largely unclear. Here we report that N6-methyladenosine (m6A), the most abundant base modification of RNA, promotes efficient initiation of protein translation from circRNAs in human cells. We discover that consensus m6A motifs are enriched in circRNAs and a single m6A site is sufficient to drive translation initiation. This m6A-driven translation requires initiation factor eIF4G2 and m6A reader YTHDF3, and is enhanced by methyltransferase METTL3/14, inhibited by demethylase FTO, and upregulated upon heat shock. Further analyses through polysome profiling, computational prediction and mass spectrometry reveal that m6A-driven translation of circRNAs is widespread, with hundreds of endogenous circRNAs having translation potential. Our study expands the coding landscape of human transcriptome, and suggests a role of circRNA-derived proteins in cellular responses to environmental stress.

Abstract Accurate annotation of coding regions in RNAs is essential for understanding gene translation. We developed a deep neural network to directly predict and analyze translation initiation and termination sites from RNA sequences. Trained with human transcripts, our model learned hidden rules of translation control and achieved a near perfect prediction of translation sites across entire transcriptome. Our model revealed a surprising role of codon usage in regulating translation termination, which was experimentally validated. We also identified thousands of new open reading frames in mRNAs or annotated lncRNAs, some of which were confirmed experimentally. Remarkably, the model trained with human mRNAs achieved high prediction accuracy in all eukaryotes and good prediction in polycistronic transcripts from prokaryotes or RNA viruses, suggesting a high degree of conservation in translation control. Collectively, this study presents a general and efficient deep learning model for RNA translation, providing new insights into the complexity of translation regulation.

Abstract Although most eukaryotic mRNAs require a 5′-cap for translation initiation, some can also be translated through a poorly studied cap-independent pathway. Here we developed a circRNA-based system and unbiasedly identified more than 10,000 sequences in the human transcriptome that contain Cap-independent Translation Initiators (CiTIs). Surprisingly, most of the identified CiTIs are located in 3′UTRs, which mainly promote translation initiation in mRNAs bearing highly structured 5′UTR. Mechanistically, CiTI recruits several translation initiation factors including eIF3 and DHX29, which in turn unwind 5′UTR structures and facilitate ribosome scanning. Functionally, we showed that the translation of HIF1A mRNA, an endogenous DHX29 target, is antagonistically regulated by its 5′UTR structure and a new 3′-CiTI in response to hypoxia. Therefore, deletion of 3′-CiTI suppresses cell growth in hypoxia and tumor progression in vivo . Collectively, our study uncovers a new regulatory mode for translation where the 3′UTR actively participate in the translation initiation.

Circular RNAs (circRNAs) are a class of abundant RNAs with ambiguous function. Although some circRNAs can be translated through IRES driven mechanisms, the scope and functions of circRNA translation are unclear because endogenous IRESs are rare. To determine the prevalence and mechanism of circRNA translation, we developed a cell-based system to screen random sequences and identified 97 overrepresented AU-rich hexamers (>2% of all hexamers) that drive cap-independent translation of circRNAs. These IRES-like short elements are significantly enriched in circRNAs and sufficient to drive circRNA translation. We further identified multiple trans -acting factors that bind these IRES-like short elements to initiate translation. Using mass-spectrometry data, hundreds of circRNA-coded peptides were identified, most of which have low abundance due to rapid degradation. As judged by mass-spectrometry, 50% of endogenous circRNAs undergo rolling circle translation, several of which were experimentally validated by western blotting. Consistently, the mutation of the IRES-like short element in a circRNA reduced its translation. Collectively, our findings suggest a pervasive translation of circRNAs, providing profound implications in circRNA function.

Arginine methylation, catalyzed by various protein arginine methyltransferases (PRMTs), is increasingly recognized as a widespread post-translational modification in eukaryotes. Thousands of proteins undergo arginine methylation, however, a full picture of the catalytic network for each PRMT is lacking, limiting the global understanding of their biological roles. In this study, we reported a systematic identification of interacting proteins for all human PRMTs, and the resulting interactomes are significantly overlapped with the known proteins containing methylarginine. The conserved motifs for arginine methylation by each PRMT were further determined, with several novel motifs being validated. Among different PRMTs, we found a high degree of overlap in their substrates and high similarities between their putative methylation motifs, suggesting possible functional complementation. We demonstrated that arginine methylation is significantly enriched in RNA binding proteins involved in regulating RNA splicing and translation. Consistently, inhibition of PRMTs leads to global alteration of alternative splicing and suppression of translation. In particular, the ribosomal proteins are pervasively modified with methylarginine, and the mutations on methylation sites inhibit ribosome assembly and translation. Collectively, this study provides a global network of different PRMTs and putative substrates, revealing critical functions of arginine methylation in the regulation of mRNA splicing and translation.

Abstract Sphingolipids are important structural components of cell membranes and prominent signaling molecules controlling cell growth, differentiation, and apoptosis. Sphingolipids are particularly abundant in the brain, and defects in sphingolipid degradation are associated with several human neurodegenerative diseases. However, molecular mechanisms governing sphingolipid metabolism remain unclear. Here we report that sphingolipid degradation is under transcriptional control of SIRT1, a highly conserved mammalian NAD + -dependent protein deacetylase, in mouse embryonic stem cells (mESCs). Deletion of SIRT1 results in accumulation of sphingomyelin in mESCs, primarily due to reduction of SMPDL3B, a GPI-anchored plasma membrane bound sphingomyelin phosphodiesterase. Mechanistically, SIRT1 regulates transcription of Smpdl3b through c-Myc. Functionally, SIRT1 deficiency-induced accumulation of sphingomyelin increases membrane fluidity and impairs neural differentiation in vitro and in vivo . Our findings discover a key regulatory mechanism for sphingolipid homeostasis and neural differentiation, further imply that pharmacological manipulation of SIRT1-mediated sphingomyelin degradation might be beneficial for treatment of human neurological diseases.