Abstract Integrating single-cell measurements that capture different properties of the genome is vital to extending our understanding of genome biology. This task is challenging due to the lack of a shared axis across datasets obtained from different types of single-cell experiments. For most such datasets, we lack corresponding information among the cells (samples) and the measurements (features). In this scenario, unsupervised algorithms that are capable of aligning single-cell experiments are critical to learning an in silico co-assay that can help draw correspondences among the cells. Maximum mean discrepancy-based manifold alignment (MMD-MA) is such an unsupervised algorithm. Without requiring correspondence information, it can align single-cell datasets from different modalities in a common shared latent space, showing promising results on simulations and a small-scale single-cell experiment with 61 cells. However, it is essential to explore the applicability of this method to larger single-cell experiments with thousands of cells so that it can be of practical interest to the community. In this paper, we apply MMD-MA to two recent datasets that measure transcriptome and chromatin accessibility in ~2000 single cells. To scale the runtime of MMD-MA to a more substantial number of cells, we extend the original implementation to run on GPUs. We also introduce a method to automatically select one of the user-defined parameters, thus reducing the hyperparameter search space. We demonstrate that the proposed extensions allow MMD-MA to accurately align state-of-the-art single-cell experiments.

Abstract Mammalian development is associated with extensive changes in gene expression, chromatin accessibility, and nuclear structure. Here, we follow such changes associated with mouse embryonic stem cell differentiation and X inactivation by integrating, for the first time, allele-specific data obtained by high-throughput single-cell RNA-seq, ATAC-seq, and Hi-C. In differentiated cells, contact decay profiles, which clearly distinguish the active and inactive X chromosomes, reveal loss of the inactive X-specific structure at mitosis followed by a rapid reappearance, suggesting a ‘bookkeeping’ mechanism. In differentiating embryonic stem cells, changes in contact decay profiles are detected in parallel on both the X chromosomes and autosomes, suggesting profound simultaneous reorganization. The onset of the inactive X-specific structure in single cells is notably delayed relative to that of gene silencing, consistent with the idea that chromatin compaction is a late event of X inactivation. Novel computational approaches to effectively align single-cell gene expression, chromatin accessibility, and 3D chromosome structure reveal that long-range structural changes to chromosomes appear as discrete events, unlike progressive changes in gene expression and chromatin accessibility.

The number and escape levels of genes that escape X chromosome inactivation (XCI) in female somatic cells vary among tissues and cell types, potentially contributing to specific sex differences. Here we investigate the role of CTCF, a master chromatin conformation regulator, in regulating escape from XCI. CTCF binding profiles and epigenetic features were systematically examined at constitutive and facultative escape genes using mouse allelic systems to distinguish the inactive X (Xi) and active X (Xa) chromosomes.We found that escape genes are located inside domains flanked by convergent arrays of CTCF binding sites, consistent with the formation of loops. In addition, strong and divergent CTCF binding sites often located at the boundaries between escape genes and adjacent neighbors subject to XCI would help insulate domains. Facultative escapees show clear differences in CTCF binding dependent on their XCI status in specific cell types/tissues. Concordantly, deletion but not inversion of a CTCF binding site at the boundary between the facultative escape gene Car5b and its silent neighbor Siah1b resulted in loss of Car5b escape. Reduced CTCF binding and enrichment of a repressive mark over Car5b in cells with a boundary deletion indicated loss of looping and insulation. In mutant lines in which either the Xi-specific compact structure or its H3K27me3 enrichment was disrupted, escape genes showed an increase in gene expression and associated active marks, supporting the roles of the 3D Xi structure and heterochromatic marks in constraining levels of escape.Our findings indicate that escape from XCI is modulated both by looping and insulation of chromatin via convergent arrays of CTCF binding sites and by compaction and epigenetic features of the surrounding heterochromatin.

The mammalian inactive X chromosome (Xi) condenses into a bipartite structure with two superdomains of frequent long-range contacts separated by a boundary or hinge region. Using in situ DNase Hi-C in mouse cells with deletions or inversions within the hinge we show that the conserved repeat locus Dxz4 alone is sufficient to maintain the bipartite structure and that Dxz4 orientation controls the distribution of long-range contacts on the Xi. Frequent long-range contacts between Dxz4 and the telomeric superdomain are either lost after its deletion or shifted to the centromeric superdomain after its inversion. This massive reversal in contact distribution is consistent with the reversal of CTCF motif orientation at Dxz4. De-condensation of the Xi after Dxz4 deletion is associated with partial restoration of TADs normally attenuated on the Xi, and with an increase in chromatin accessibility and CTCF binding on the Xi after Dxz4 deletion or inversion, but few changes in gene expression, in accordance with multiple epigenetic mechanisms ensuring X silencing. We propose that Dxz4 represents a structural platform for frequent long-range contacts with multiple loci in a direction dictated by the orientation of a bank of CTCF motifs at Dxz4, which may work as a ratchet to form the distinctive bipartite structure of the condensed Xi.

Background: Hypergonadotropic hypogonadism (HH) is characterized by low sex steroid levels and secondarily elevated gonadotropin levels with either congenital or acquired etiology. Genetic factors leading to HH have yet to be fully elucidated. Methods: Here, we report on genome and transcriptome data analyses from a male patient with HH and history of growth delay who has an inherited deletion of chromosome Xq28. Furthermore, expression analyses were done for this patient and his unaffected family members and compared to normal controls to identify dysregulated genes due to this deletion. Results: Our patient's Xq28 deletion is 44,806bp and contains only two genes FUNDC2 and CMC4. Expression of both FUNDC2 and CMC4 are completely abolished in the patient. Gene ontology analyses of differentially expressed genes in the patient in comparison to controls show that significantly up-regulated genes in the patient are enriched in Sertoli cell barrier regulation, apoptosis, inflammatory response and gonadotropin-releasing regulation. Indeed, our patient has an elevated FSH level, which regulates Sertoli cell proliferation and spermatogenesis. In his mother and sister, who are heterozygous for this deletion, X-chromosome inactivation is skewed towards the deleted X, suggesting a mechanism to avoid FSH dysregulation. Conclusion: Compared to the previously reported men with variable sized Xq28 deletions, our study suggests that loss of function of FUNDC2 and/or CMC4 results in dysregulation of apoptosis, inflammation and FSH, and is sufficient to cause Xq28-associated HH.

In addition to its known roles in protein synthesis and enzyme catalysis, RNA has been proposed to stabilize higher-order chromatin structure. To distinguish presumed architectural roles of RNA from other functions, we applied a ribonuclease digestion strategy to our CUT&RUN in situ chromatin profiling method (CUT&RUN.RNase). We find that depletion of RNA compromises association of the murine nucleolar protein Nucleophosmin with pericentric heterochromatin and alters the chromatin environment of CCCTC-binding factor (CTCF) bound regions. Strikingly, we find that RNA maintains the integrity of both constitutive (H3K9me3 marked) and facultative (H3K27me3 marked) heterochromatic regions as compact domains, but only moderately stabilizes euchromatin. To establish the specificity of heterochromatin stabilization by RNA, we performed CUT&RUN on cells deleted for the Firre long non-coding RNA and observed disruption of H3K27me3 domains on several chromosomes. We conclude that RNA maintains local and global chromatin organization by acting as a structural scaffold for heterochromatic domains.

To investigate the potential molecular mechanism of miR-34a in Sjögren's syndrome (SS). Transmission electron microscopy was used to observe the salivary gland tissues of mild and severe SS patients. SS mouse model was constructed and injected with miR-34a antagonist. HSGE cells were transfected with miR-34a mimic. Starbase predicted miR-34a binding sites and validated them with dual-luciferase reporter assays. Immunohistochemistry, HE staining, CCK-8, TUNEL assay, flow cytometry, immunofluorescence and Western Blot were used to investigate the effects of miR-34a on NF-κB signaling and mitochondrial pathway of apoptosis in HSGE cells. Severe SS patients showed obvious mitochondrial damage and apoptosis in salivary glands. MiR-34a was overexpressed and NF-κB signaling is activated in salivary glands of severe SS patients. Inhibition of miR-34a alleviated salivary gland injury in SS mice, as well as inhibited the activation of NF-κB signaling and mitochondrial pathway of apoptosis. In conclusion, miR-34a promoted NF-κB signaling by targeting IκBα, thereby causing mitochondrial pathway apoptosis and aggravating SS-induced salivary gland damage.

Abstract X chromosome inactivation (XCI) is a female-specific process in which one X chromosome is silenced to balance X-linked gene expression between the sexes. XCI is initiated in early development by upregulation of the lncRNA Xist on the future inactive X (Xi). A subset of X-linked genes escape silencing and thus have higher expression in females, suggesting female-specific functions. One of these genes is the highly conserved gene Kdm6a , which encodes a histone demethylase that removes methyl groups at H3K27 to facilitate gene expression. Here, we investigate the role of KDM6A in the regulation of Xist . We observed impaired upregulation of Xist during early stages of differentiation in hybrid mouse ES cells following CRISPR/Cas9 knockout of Kdm6a . This is associated with reduced Xist RNA coating of the Xi, suggesting diminished XCI potency. Indeed, Kdm6a knockout results in aberrant overexpression of genes from the Xi after differentiation. KDM6A binds to the Xist promoter and knockout cells show an increase in H3K27me3 at Xist . These results indicate that KDM6A plays a role in the initiation of XCI through histone demethylase-dependent activation of Xist during early differentiation.

Firre encodes a lncRNA involved in nuclear organization in mammals. Here we find that Firre RNA is transcribed from the active X chromosome (Xa) and exerts trans-acting effects on the inactive X chromosome (Xi). Allelic deletion of Firre on the Xa in a mouse hybrid fibroblast cell line results in a dramatic loss of the histone modification H3K27me3 and of components of the PRC2 complex on the Xi as well as the disruption of the perinucleolar location of the Xi. These features are measurably rescued by ectopic expression of a mouse or human Firre/FIRRE cDNA transgene, strongly supporting a conserved trans-acting role of the Firre transcript in maintaining the Xi heterochromatin environment. Surprisingly, CTCF occupancy is decreased on the Xi upon loss of Firre RNA, but is partially recovered by ectopic transgene expression, suggesting a functional link between Firre RNA and CTCF in maintenance of epigenetic features and/or location of the Xi. Loss of Firre RNA results in dysregulation of genes implicated in cell division and development, but not in reactivation of genes on the Xi, which retains its bipartite structure despite some changes in chromatin contact distribution. Allelic deletion or inversion of Firre on the Xi causes localized redistribution of chromatin contacts, apparently dependent on the orientation of CTCF binding sites clustered at the locus. Thus, the Firre locus and its RNA have roles in the maintenance of epigenetic features and structure of the Xi.