Abstract Ancestral sequence reconstruction is a technique that is gaining widespread use in molecular evolution studies and protein engineering. Accurate reconstruction requires the ability to handle appropriately large numbers of sequences, as well as insertion and deletion (“indel”) events, but available approaches exhibit limitations. To address these limitations, we developed Graphical Representation of Ancestral Sequence Predictions (GRASP), which efficiently implements maximum likelihood methods to enable the inference of ancestors of families with more than 10,000 members. GRASP implements partial order graphs (POGs) to represent and infer insertion and deletion events across ancestors, enabling the identification of building blocks for protein engineering. To validate the capacity to engineer novel proteins from realistic data, we predicted ancestor sequences across three distinct enzyme families: glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductases, cytochromes P450, and dihydroxy/sugar acid dehydratases (DHAD). All tested ancestors demonstrated enzymatic activity. Our study demonstrates the ability of GRASP (1) to support large data sets over 10,000 sequences and (2) to employ insertions and deletions to identify building blocks for engineering biologically active ancestors, by exploring variation over evolutionary time. Author summary Massive sequencing projects expose the extent of natural, genetic diversity. Here, we describe a method with capacity to perform ancestor sequence reconstruction from data sets in excess of 10,000 sequences, poised to recover ancestral diversity, including the evolutionary events that determine present-time biological function and structure. We introduce a novel strategy for suggesting “indel variants” that are distinct from, but can be explored alongside, substitution variants for creating ancestral libraries. We demonstrate how indels can be used as building blocks to form “hybrid ancestors”; based on this strategy, we synthesise ancestor variants, with varying enzymatic activities, for wide-ranging applications in the biotechnology sector.

Abstract Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) tumours develop and progress via complex remodelling of the kidney epigenome, transcriptome, proteome, and metabolome. Given the subsequent tumour and inter-patient heterogeneity, drug-based treatments report limited success, calling for multi-omics studies to extract regulatory relationships, and ultimately, to develop targeted therapies. However, current methods are unable to extract nonlinear multi-omics perturbations. Here, we present SiRCle ( Si gnature Re gulatory Cl ust e ring), a novel method to integrate DNA methylation, RNA-seq and proteomics data. Applying SiRCle to a case study of ccRCC, we disentangle the layer (DNA methylation, transcription and/or translation) where dys-regulation first occurs and find the primary biological processes altered. Next, we detect regulatory differences between patient subsets by using a variational autoencoder to integrate omics’ data followed by statistical comparisons on the integrated space. In ccRCC patients, SiRCle allows to identify metabolic enzymes and cell-type-specific markers associated with survival along with the likely molecular driver behind the gene’s perturbations.

ABSTRACT A prominent aspect of most, if not all, central nervous systems (CNSs) is that anterior regions (brain) are larger than posterior ones (spinal cord). Studies in Drosophila and mouse have revealed that the Polycomb Repressor Complex 2 (PRC2), a protein complex responsible for applying key repressive histone modifications, acts by several mechanisms to promote anterior CNS expansion. However, it is unclear what the full spectrum of PRC2 action is during embryonic CNS development and how PRC2 integrates with the epigenetic landscape. We removed PRC2 function from the developing mouse CNS, by mutating the key gene Eed , and generated spatio-temporal transcriptomic data. To decode the role of PRC2, we developed a method that incorporates standard statistical analyses with probabilistic deep learning to integrate the transcriptomic response to PRC2 inactivation with epigenetic information from ENCODE. This multi-variate analysis corroborates the central involvement of PRC2 in anterior CNS expansion, and reveals layered regulation via PRC2. These findings uncover a differential logic for the role of PRC2 upon functionally distinct gene categories that drive CNS anterior expansion. To support the analysis of emerging multi-modal datasets, we provide a novel bioinformatics package that integrates transcriptomic and epigenetic datasets to identify regulatory underpinnings of heterogeneous biological processes.

ABSTRACT Fumarate Hydratase (FH) is a mitochondrial enzyme that catalyses the reversible hydration of fumarate to malate in the TCA cycle. Germline mutations of FH lead to HLRCC, a cancer syndrome characterised by a highly aggressive form of renal cancer( 1 ). Although HLRCC tumours metastasise rapidly, FH-deficient mice develop premalignant cysts in the kidneys, rather than carcinomas ( 2 ). How Fh1 -deficient cells overcome these tumour suppressive events during transformation is unknown. Here, we perform a genome-wide CRISPR/Cas9 screen to identify genes that, when ablated, enhance the proliferation of Fh1 -deficient cells. We found that the depletion of HIRA enhances proliferation and invasion of Fh1 -deficient cells in vitro and in vivo . Mechanistically, Hira loss enables the activation of MYC and its target genes, increasing nucleotide metabolism specifically in Fh1 -deficient cells, independent of its histone chaperone activity. These results are instrumental for understanding mechanisms of tumorigenesis in HLRCC and the development of targeted treatments for patients.

Sequence-function data provides valuable information about the protein functional landscape, but is rarely obtained during directed evolution campaigns. Here, we present Long-read every variant Sequencing (LevSeq), a pipeline that combines a dual barcoding strategy with nanopore sequencing to rapidly generate sequence-function data for entire protein-coding genes. LevSeq integrates into existing protein engineering workflows and comes with open-source software for data analysis and visualization. The pipeline facilitates data-driven protein engineering by consolidating sequence-function data to inform directed evolution and provide the requisite data for machine learning-guided protein engineering (MLPE). LevSeq enables quality control of mutagenesis libraries prior to screening, which reduces time and resource costs. Simulation studies demonstrate LevSeq's ability to accurately detect variants under various experimental conditions. Finally, we show LevSeq's utility in engineering protoglobins for new-to-nature chemistry. Widespread adoption of LevSeq and sharing of the data will enhance our understanding of protein sequence-function landscapes and empower data-driven directed evolution.

Abstract Accurately identifying cell populations is paramount to the quality of downstream analyses and overall interpretations of single-cell RNA-seq (scRNA-seq) datasets but remains a challenge. The quality of single-cell clustering depends on the proximity metric used to generate cell-to-cell distances. Accordingly, proximity metrics have been benchmarked for scRNA-seq clustering, typically with results averaged across datasets to identify a highest performing metric. However, the ‘best-performing’ metric varies between studies, with the performance differing significantly between datasets. This suggests that the unique structural properties of a scRNA-seq dataset, specific to the biological system under study, has a substantial impact on proximity metric performance. Previous benchmarking studies have omitted to factor the structural properties into their evaluations. To address this gap, we developed a framework for the in-depth evaluation of the performance of 17 proximity metrics with respect to core structural properties of scRNA-seq data, including sparsity, dimensionality, cell population distribution and rarity. We find that clustering performance can be improved substantially by the selection of an appropriate proximity metric and neighbourhood size for the structural properties of a dataset, in addition to performing suitable pre-processing and dimensionality reduction. Furthermore, popular metrics such as Euclidean and Manhattan distance performed poorly in comparison to several lessor applied metrics, suggesting the default metric for many scRNA-seq methods should be re-evaluated. Our findings highlight the critical nature of tailoring scRNA-seq analyses pipelines to the system under study and provide practical guidance for researchers looking to optimise cell similarity search for the structural properties of their own data.

Abstract Hereditary Leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC) is a cancer syndrome caused by inactivating germline mutations in fumarate hydratase (FH) and subsequent accumulation of fumarate. Fumarate accumulation leads to the activation of an anti-oxidant response via nuclear translocation of the transcription factor NRF2. The activation of the anti-oxidant response is key for cellular survival in FH-deficient cells, yet the extent to which chromatin remodelling shapes the anti-oxidant response is currently unknown. Here, we explored the global effects of FH loss on the chromatin landscape to identify transcription factor networks involved in the highly remodelled chromatin landscape of FH-deficient cells. We identify FOXA2 as a key transcription factor which directly regulates anti-oxidant response genes and subsequent metabolic rewiring. Moreover, we also find that FOXA2 regulates anti-oxidant genes independent of the canonical anti-oxidant regulator NRF2. The identification of FOXA2 as an anti-oxidant regulator provides new insights into the molecular mechanisms behind cell responses to fumarate accumulation, and potentially provides new avenues for therapeutic intervention for HLRCC.