Abstract Cryo-FIB/SEM combined with cryo-ET has emerged from within the field of cryo-EM as the method for obtaining the highest resolution structural information of complex biological samples in-situ in native and non-native environments. However, challenges remain in conventional cryo-FIB/SEM workflows, including milling thick specimens that do not vitrify well, specimens with preferred orientation, low-throughput when milling small and/or low concentration specimens, and cellular specimens that distribute poorly across grid squares. Here we present a general approach we call the ‘Waffle Method’ which leverages high-pressure freezing to address these challenges. We illustrate the mitigation of these challenges by applying the Waffle Method and cryo-ET to reveal the macrostructure of the polar tube in microsporidian spores in multiple complementary orientations, which was previously not possible due to preferred orientation of the spores on the grid. We demonstrate the broadness of the Waffle Method by applying it to three additional cellular samples and a single particle sample using a variety of cryo-FIB-milling hardware, with both manual and automated approaches. We also present a unique and critical stress-relief gap designed specifically for waffled lamellae. Additionally, we describe applications of the Waffle Method which are currently being explored. We propose the Waffle Method as a way to achieve many of the advantages of cryo-liftout on the specimen grid while avoiding the long, challenging, and technically-demanding process required for cryo-liftout.

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is becoming the preferred method for resolving protein structure. Low signal-to-noise (SNR) in cryoEM images reduces the confidence and throughput of structure determination during several steps of data processing, resulting in impediments such as missing particle orientations. Denoising cryoEM images can not only improve downstream analysis but also accelerate the time-consuming data collection process by allowing lower electron dose micrographs to be used for analysis without compromising structural interpretability. Here, we present Topaz-Denoise, a deep learning method for reliably increasing the SNR of cryoEM images in seconds. By training on a dataset composed of thousands of micrographs collected across a wide range of imaging conditions, we are able to learn models capturing the complexity of the cryoEM image formation process. While this general idea has been deployed successfully in natural imaging, protein threading, and proteomics, it has yet to be applied systematically in cryoEM where the lack of ground truth signal has been a long-standing limitation. To address this, we make the key insight that forming paired, independent micrographs from even and odd camera movie frames enables us to train denoising models without observing ground truth signal. We demonstrate that our denoising model improves SNR by roughly 100x over raw micrographs and 1.8x over other methods. Notably, we show that denoising with our general model enables solving the first 3D single particle structure of clustered protocadherin, an elongated particle with previously-elusive views. Topaz-Denoise and pre-trained general models are now included in Topaz (https://github.com/tbepler/topaz), a free and open-source software package that focuses on particle picking, and has been integrated into the Appion cryoEM suite. We expect that Topaz-Denoise will be of broad utility to the cryoEM community for improving micrograph interpretability and accelerating analysis.

Recent advances in instrumentation and software for cryoEM have increased the applicability and utility of this method. Coupled with the adoption of automated pipelines, significant infrastructure support is required to sustain high throughput workflows. In particular, data generation rates may outpace the ability to deploy data storage and archival solutions. We have investigated what effects data compression and conversion to different file formats have on the ability to obtain high resolution cryoEM reconstructions. Standard lossless data compression strategies have a high impact on reducing the size of direct detector electron counting movie stacks, but provide more modest gains for aligned summed images. We show that EM images can be compressed using standard lossy methods to reduce file storage to 5-10% of the size of the original aligned sum or movie stack file and yet still retain enough information such that modern image processing pipelines will provide sub-2Å reconstructions from the compressed data.