Abstract Alternative splicing shapes the phenotype of cells in development and disease. Long-read RNA-sequencing recovers full-length transcripts but has limited throughput at the single-cell level. Here we developed single-cell full-length transcript sequencing by sampling ( FLT-seq ), together with the computational pipeline FLAMES to overcome these issues and perform isoform discovery and quantification, splicing analysis and mutation detection in single cells. With FLT-seq and FLAMES , we performed the first comprehensive characterization of the full-length isoform landscape in single cells of different types and species and identified thousands of unannotated isoforms. We found conserved functional modules that were enriched for alternative transcript usage in different cell populations, including ribosome biogenesis and mRNA splicing. Analysis at the transcript-level allowed data integration with scATAC-seq on individual promoters, improved correlation with protein expression data and linked mutations known to confer drug resistance to transcriptome heterogeneity. Our methods reveal previously unseen isoform complexity and provide a better framework for multi-omics data integration.

The dystrophin protein has well-characterized roles in force transmission and maintaining membrane integrity during muscle contraction. Studies have reported decreased expression of dystrophin in atrophying muscles during wasting conditions, and that restoration of dystrophin can attenuate atrophy, suggesting a role in maintaining muscle mass. Phosphorylation of S3059 within the cysteine-rich region of dystrophin enhances binding between dystrophin and β-dystroglycan, and mimicking phosphorylation at this site by site-directed mutagenesis attenuates myotube atrophy in vitro. To determine whether dystrophin phosphorylation can attenuate muscle wasting in vivo, CRISPR-Cas9 was used to generate mice with whole body mutations of S3059 to either alanine (DmdS3059A) or glutamate (DmdS3059E), to mimic a loss of, or constitutive phosphorylation of S3059, on all endogenous dystrophin isoforms, respectively. Sciatic nerve transection was performed on these mice to determine whether phosphorylation of dystrophin S3059 could attenuate denervation atrophy. At 14 days post denervation, atrophy of tibialis anterior (TA) but not gastrocnemius or soleus muscles, was partially attenuated in DmdS3059E mice relative to WT mice. Attenuation of atrophy was associated with increased expression of β-dystroglycan in TA muscles of DmdS3059E mice. Dystrophin S3059 phosphorylation can partially attenuate denervation-induced atrophy, but may have more significant impact in less severe modes of muscle wasting.

Abstract Cancer cachexia is a tumour-induced wasting syndrome, characterised by extreme loss of skeletal muscle. Defective mitochondria can contribute to muscle wasting; however, the underlying mechanisms remain unclear. Using a Drosophila larval model of cancer cachexia, we observed enlarged and dysfunctional muscle mitochondria. Morphological changes were accompanied by upregulation of beta-oxidation proteins and depletion of muscle glycogen and lipid stores. Muscle lipid stores were also decreased in Colon-26 adenocarcinoma mouse muscle samples, and expression of the beta-oxidation gene CPT1A was negatively associated with muscle quality in cachectic patients. Mechanistically, mitochondrial defects result from reduced muscle insulin signalling, downstream of tumour-secreted insulin growth factor binding protein (IGFBP) homolog ImpL2. Strikingly, muscle-specific inhibition of Forkhead box O (FOXO), mitochondrial fusion, or beta-oxidation in tumour-bearing animals preserved muscle integrity. Finally, dietary supplementation with nicotinamide or lipids, improved muscle health in tumour-bearing animals. Overall, our work demonstrates that muscle FOXO, mitochondria dynamics/beta-oxidation and lipid utilisation are key regulators of muscle wasting in cancer cachexia.

SUMMARY Pathogenic variants in alpha kinase 3 ( ALPK3 ) cause cardiomyopathy and musculoskeletal disease. How ALPK3 mutations result in disease remains unclear because little is known about this atypical kinase. Using a suite of engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) we show that ALPK3 localizes to the M-Band of the sarcomere. ALPK3 deficiency disrupted sarcomeric organization and calcium kinetics in hPSC-derived cardiomyocytes and reduced force generation in cardiac organoids. Phosphoproteomic profiling identified ALPK3-dependant phospho-peptides that were enriched for sarcomeric components of the M-band and the ubiquitin-binding protein SQSTM1. Analysis of the ALPK3 interactome confirmed binding to M-band proteins including SQSTM1. Importantly, in hPSC-derived cardiomyocytes modeling ALPK3 deficiency and cardiomyopathic ALPK3 mutations, sarcomeric organization and M-band localization ofSQSTM1 were abnormal. These data suggest ALPK3 has an integral role in maintaining sarcomere integrity and proteostasis in striated muscle. We propose this mechanism may underly disease pathogenesis in patients with ALPK3 variants.

SUMMARY Skeletal muscle contains a resident population of somatic stem cells capable of both self-renewal and differentiation. The signals that regulate this important decision have yet to be fully elucidated. Here we use metabolomics and mass spectrometry imaging (MSI) to identity a state of localized hyperglycaemia following skeletal muscle injury. We show that committed muscle progenitor cells exhibit an enrichment of glycolytic and TCA cycle genes and that extracellular monosaccharide availability regulates intracellular citrate levels and global histone acetylation. Muscle stem cells exposed to a reduced (or altered) monosaccharide environment demonstrate reduced global histone acetylation and transcription of myogenic determination factors (including myod1 ). Importantly, reduced monosaccharide availability was linked directly to increased rates of asymmetric division and muscle stem cell self-renewal in regenerating skeletal muscle. Our results reveal an important role for the extracellular metabolic environment in the decision to undergo self-renewal or myogenic commitment during skeletal muscle regeneration.