Abstract Evaluating metagenomic software is key for optimizing metagenome interpretation and focus of the Initiative for the Critical Assessment of Metagenome Interpretation (CAMI). The CAMI II challenge engaged the community to assess methods on realistic and complex datasets with long- and short-read sequences, created computationally from around 1,700 new and known genomes, as well as 600 new plasmids and viruses. Here we analyze 5,002 results by 76 program versions. Substantial improvements were seen in assembly, some due to long-read data. Related strains still were challenging for assembly and genome recovery through binning, as was assembly quality for the latter. Profilers markedly matured, with taxon profilers and binners excelling at higher bacterial ranks, but underperforming for viruses and Archaea. Clinical pathogen detection results revealed a need to improve reproducibility. Runtime and memory usage analyses identified efficient programs, including top performers with other metrics. The results identify challenges and guide researchers in selecting methods for analyses.

Periodontitis is an extremely prevalent disease worldwide and is driven by complex dysbiotic microbiota. Here we analyzed the transcriptional activity of the periodontal pocket microbiota from all domains of life as well as the human host in health and chronic periodontitis. Bacteria showed strong enrichment of 18 KEGG functional modules in chronic periodontitis, including bacterial chemotaxis, flagellar assembly, type III secretion system, type III CRISPR-Cas system, and two component system proteins. Upregulation of these functions was driven by the red-complex pathogens and candidate pathogens, e.g. Filifactor alocis, Prevotella intermedia, Fretibacterium fastidiosum and Selenomonas sputigena. Nine virulence factors were strongly up-regulated, among them the arginine deiminase arcA from Porphyromonas gingivalis and Mycoplasma arginini. Viruses and archaea accounted for about 0.1% and 0.22% of total putative mRNA reads, respectively, and a protozoan, Entamoeba gingivalis, was highly enriched in periodontitis. Fourteen human transcripts were enriched in periodontitis, including a gene for a ferric iron binding protein, indicating competition with the microbiota for iron, and genes associated with cancer, namely nucleolar phosphoprotein B23, ankyrin-repeat domain 30B-like protein and beta-enolase. The data provide evidence on the level of gene expression in vivo for the potentially severe impact of the dysbiotic microbiota on human health.

Abstract Evaluating metagenomic software is key for optimizing metagenome interpretation and focus of the community-driven initiative for the Critical Assessment of Metagenome Interpretation (CAMI). In its second challenge, CAMI engaged the community to assess their methods on realistic and complex metagenomic datasets with long and short reads, created from ∼1,700 novel and known microbial genomes, as well as ∼600 novel plasmids and viruses. Altogether 5,002 results by 76 program versions were analyzed, representing a 22x increase in results. Substantial improvements were seen in metagenome assembly, some due to using long-read data. The presence of related strains still was challenging for assembly and genome binning, as was assembly quality for the latter. Taxon profilers demonstrated a marked maturation, with taxon profilers and binners excelling at higher bacterial taxonomic ranks, but underperforming for viruses and archaea. Assessment of clinical pathogen detection techniques revealed a need to improve reproducibility. Analysis of program runtimes and memory usage identified highly efficient programs, including some top performers with other metrics. The CAMI II results identify current challenges, but also guide researchers in selecting methods for specific analyses.

Abstract “Red tides” are harmful algal blooms (HABs) caused by dinoflagellate microalgae that accumulate toxins lethal to other organisms, including humans via consumption of contaminated seafood. Increasingly frequent, HABs are driven by a combination of environmental factors including nutrient enrichment, particularly in warm waters. Here, we present the de novo assembled genome (~4.75 Gbp), transcriptome, proteome, and metabolome from Prorocentrum cordatum , a globally abundant, bloom-forming dinoflagellate. Using axenic algal cultures, we studied the molecular mechanisms that underpin response to temperature stress, which is relevant to current ocean warming trends. We discovered a complementary interplay between RNA editing and exon usage that regulates the expression and functional diversity of biomolecules, reflected by reduction in photosynthesis, central metabolism, and protein synthesis. Our multi-omics analyses uncover the molecular response to heat stress in an important HAB species, which is driven by complex gene structures in a large, high-G+C genome, combined with multi-level transcriptional regulation.

Abstract Infection with human cytomegalovirus (HCMV) can cause severe complications in immunocompromised individuals and congenitally infected children. Characterizing heterogeneous viral populations and their evolution by high-throughput sequencing of clinical specimens requires the accurate assembly of individual strains or sequence variants and suitable variant calling methods. However, the performance of most methods has not been assessed for populations composed of low divergent viral strains with large genomes, such as HCMV. In an extensive benchmarking study, we evaluated 15 assemblers and six variant callers on ten lab-generated benchmark data sets created with two different library preparation protocols, to identify best practices and challenges for analyzing such data. Most assemblers, especially metaSPAdes and IVA, performed well across a range of metrics in recovering abundant strains. However, only one, Savage, recovered low abundant strains and in a highly fragmented manner. Two variant callers, LoFreq and VarScan2, excelled across all strain abundances. Both shared a large fraction of false positive (FP) variant calls, which were strongly enriched in T to G changes in a “G.G” context. The magnitude of this context-dependent systematic error is linked to the experimental protocol. We provide all benchmarking data, results and the entire benchmarking workflow named QuasiModo, Quasi species M etric d etermination o n o mics, under the GNU General Public License v3.0 ( https://github.com/hzi-bifo/Quasimodo ), to enable full reproducibility and further benchmarking on these and other data.

In viral infections often multiple related viral strains are present, due to coinfection or within-host evolution. We describe Haploflow, a de Bruijn graph-based assembler for de novo genome assembly of viral strains from mixed sequence samples using a novel flow algorithm. We assessed Haploflow across multiple benchmark data sets of increasing complexity, showing that Haploflow is faster and more accurate than viral haplotype assemblers and generic metagenome assemblers not aiming to reconstruct strains. Haplotype reconstructed high-quality strain-resolved assemblies from clinical HCMV samples and SARS-CoV-2 genomes from wastewater metagenomes identical to genomes from clinical isolates.

Abstract The advent of rapid whole-genome sequencing has created new opportunities for computational prediction of antimicrobial resistance (AMR) phenotypes from genomic data. Both rule-based and machine learning (ML) approaches have been explored for this task, but systematic benchmarking is still needed. Here, we evaluated four state-of-the-art ML methods (Kover, PhenotypeSeeker, Seq2Geno2Pheno, and Aytan-Aktug), an ML baseline, and the rule-based ResFinder by training and testing each of them across 78 species–antibiotic datasets, using a rigorous benchmarking workflow that integrates three evaluation approaches, each paired with three distinct sample splitting methods. Our analysis revealed considerable variation in the performance across techniques and datasets. Whereas ML methods generally excelled for closely related strains, ResFinder excelled for handling divergent genomes. Overall, Kover most frequently ranked top among the ML approaches, followed by PhenotypeSeeker and Seq2Geno2Pheno. AMR phenotypes for antibiotic classes such as macrolides and sulfonamides were predicted with the highest accuracies. The quality of predictions varied substantially across species–antibiotic combinations, particularly for beta-lactams; across species, resistance phenotyping of the beta-lactams compound, aztreonam, amox-clav, cefoxitin, ceftazidime, and piperacillin/tazobactam, alongside tetracyclines demonstrated more variable performance than the other benchmarked antibiotics. By organism, C. jejuni and E. faecium phenotypes were more robustly predicted than those of Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Salmonella enterica , Neisseria gonorrhoeae , Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa , Acinetobacter baumannii , Streptococcus pneumoniae , and Mycobacterium tuberculos is . In addition, our study provides software recommendations for each species–antibiotic combination. It furthermore highlights the need for optimization for robust clinical applications, particularly for strains that diverge substantially from those used for training.

Rapidly evolving viral pathogens such as SARS-CoV-2 continuously accumulate amino acid changes, some of which affect transmissibility, virulence or improve the virus' ability to escape host immunity. Since the beginning of the pandemic and establishment of SARS-CoV-2 as a human pathogen, multiple lineages with concerning phenotypic alterations, so called Variants of Concern (VOCs), have emerged and risen to predominance. To optimize public health management and to ensure the continued efficacy of vaccines, the early detection of such variants of interest is essential. Therefore, large-scale viral genomic surveillance programs have been initiated worldwide, with data being deposited in public repositories in a timely manner. However, technologies for their continuous interpretation are currently lacking. Here, we describe the CoVerage system (www.sarscoverage.org) for viral genomic surveillance, which continuously predicts and characterizes novel and emerging potential Variants of Interest (pVOIs) together with their antigenic and evolutionary alterations. Using the establishment of Omicron and its current sublineages as an example, we demonstrate how CoVerage can be used to quickly identify and characterize such variants. CoVerage can facilitate the timely identification and assessment of future SARS-CoV-2 Variants of Concern.

Abstract Recent advancements in artificial intelligence such as AlphaFold, have enabled more accurate prediction of protein three-dimensional structure from amino acid sequences. This has attracted significant attention, especially for the application of AlphaFold in drug discovery. However, how to take full advantage of AlphaFold to assist with virtual screening remains elusive. We evaluate the AlphaFold structures of 51 selected targets from the DUD-E database in virtual screening. Our analyses show that the virtual screening performance of about 35% of the AlphaFold structures is equivalent to that of DUD-E structures, and about 25% of the AlphaFold structures yield better results than the DUD-E structures. Remarkably, AlphaFold structures produce slightly better results than the Apo structures. Moreover, we develop a new consensus scoring method based on Z-score standardization and exponential function, which shows improved screening performance compared to traditional scoring methods. By implementing a multi-stage virtual screening process and the new consensus scoring method, we are able to improve the speed of virtual screening by about nine times without compromising the enrichment factor. Overall, our results provide insights into the potential use of AlphaFold in drug discovery and highlight the value of consensus scoring and multi-stage virtual screening.

Bacterial vaginosis (BV) is a prevalent multifactorial disease of women in their reproductive years characterized by a shift from the Lactobacillus spp. dominated microbial community towards a taxonomically diverse anaerobic community. For unknown reasons, some women do not respond to therapy. In our recent clinical study, out of 37 women diagnosed with BV, 31 were successfully treated with metronidazole, while 6 still had BV after treatment. To discover possible reasons for the lack of response in those patients, we performed a metatranscriptome analysis of their vaginal microbiota, comparing them to patients who responded. Seven out of 8 Cas genes of Gardnerella vaginalis were highly up-regulated in non-responding patients. Cas genes, in addition to protecting against phages, might be involved in DNA repair thus mitigating the bactericidal effect of DNA damaging agents like metronidazole. In the second part of our study, we analyzed the vaginal metatranscriptomes of four patients over three months and showed high in vivo expression of genes for pore-forming toxins in L. iners and of genes encoding enzymes for the production of hydrogen peroxide and D-lactate in L. crispatus.