Abstract The intestine is a complex organ that promotes digestion, extracts nutrients, participates in immune surveillance, maintains critical symbiotic relationships with microbiota and affects overall health 1 . The intesting has a length of over nine metres, along which there are differences in structure and function 2 . The localization of individual cell types, cell type development trajectories and detailed cell transcriptional programs probably drive these differences in function. Here, to better understand these differences, we evaluated the organization of single cells using multiplexed imaging and single-nucleus RNA and open chromatin assays across eight different intestinal sites from nine donors. Through systematic analyses, we find cell compositions that differ substantially across regions of the intestine and demonstrate the complexity of epithelial subtypes, and find that the same cell types are organized into distinct neighbourhoods and communities, highlighting distinct immunological niches that are present in the intestine. We also map gene regulatory differences in these cells that are suggestive of a regulatory differentiation cascade, and associate intestinal disease heritability with specific cell types. These results describe the complexity of the cell composition, regulation and organization for this organ, and serve as an important reference map for understanding human biology and disease.

Abstract The colon is a complex organ that promotes digestion, extracts nutrients, participates in immune surveillance, maintains critical symbiotic relationships with microbiota, and affects overall health. To better understand its organization, functions, and its regulation at a single cell level, we performed CODEX multiplexed imaging, as well as single nuclear RNA and open chromatin assays across eight different intestinal sites of four donors. Through systematic analyses we find cell compositions differ dramatically across regions of the intestine, demonstrate the complexity of epithelial subtypes, and find that the same cell types are organized into distinct neighborhoods and communities highlighting distinct immunological niches present in the intestine. We also map gene regulatory differences in these cells suggestive of a regulatory differentiation cascade, and associate intestinal disease heritability with specific cell types. These results describe the complexity of the cell composition, regulation, and organization for this organ, and serve as an important reference map for understanding human biology and disease.

ABSTRACT To chart cell composition and cell state changes that occur during the transformation of healthy colon to precancerous adenomas to colorectal cancer (CRC), we generated 451,886 single-cell chromatin accessibility profiles and 208,557 single-cell transcriptomes from 48 polyps, 27 normal tissues, and 6 CRCs collected from patients with and without germline APC mutations. A large fraction of polyp and CRC cells exhibit a stem-like phenotype, and we define a continuum of epigenetic and transcriptional changes occurring in these stem-like cells as they progress from normal to CRC. Advanced polyps contain increasing numbers of stem-like cells, regulatory T-cells, and a subtype of FOX-regulated pre-cancer associated fibroblasts. In the cancerous state, we observe T-cell exhaustion, RUNX1-regulated cancer associated fibroblasts, and increasing accessibility associated with HNF4A motifs in epithelia. Methylation changes in sporadic CRC are strongly anti-correlated with accessibility changes along this continuum, further identifying regulatory markers for molecular staging of polyps.

Abstract Aberrant shifts in DNA methylation have long been regarded as an early marker for cancer onset and progression. To chart DNA methylation changes that occur during the transformation from normal healthy colon tissue to malignant colorectal cancer (CRC), we collected over 50 samples from 15 familial adenomatous polyposis (FAP) and non-FAP colorectal cancer patients, and generated 30-70x whole-genome methylation sequencing (WGMS) runs via the novel Ultima Genomics ultra high-throughput sequencing platform. We observed changes in DNA methylation that occur early in the malignant transformation process, in gene promoters and in distal regulatory elements. Among these changes are events of hyper-methylation which are associated with a bivalent “poised” chromatin state at promoters and are CRC-specific. Distal enhancers show nonlinear dynamics, lose methylation in the progression from normal mucosa to dysplastic polyps but regain methylation in the adenocarcinoma state. Enhancers that gain chromatin accessibility in the adenocarcinoma state and are enriched with HOX transcription factor binding sites, a marker of developmental genes. This work demonstrates the feasibility of generating large high quality WGMS data using the Ultima Genomics platform and provides the first detailed view of methylation dynamics during CRC formation and progression in a model case.

Abstract The Human BioMolecular Atlas Program aims to compile a reference atlas for the healthy human adult body at the cellular level. Functional tissue units (FTU, e.g., renal glomeruli and colonic crypts) are of pathobiological significance and relevant for modeling and understanding disease progression. Yet, annotation of FTUs is time consuming and expensive when done manually and existing algorithms achieve low accuracy and do not generalize well. This paper compares the five winning algorithms from the “Hacking the Kidney” Kaggle competition to which more than a thousand teams from sixty countries contributed. We compare the accuracy and performance of the algorithms on a large-scale renal glomerulus Periodic acid-Schiff stain dataset and their generalizability to a colonic crypts hematoxylin and eosin stain dataset. Results help to characterize how the number of FTUs per unit area differs in relationship to their position in kidney and colon with respect to age, sex, body mass index (BMI), and other clinical data and are relevant for advancing pathology, anatomy, and surgery.

Abstract Although 3D genome architecture is essential for long-range gene regulation, the significance of distal regulatory chromatin contacts is challenged by recent findings of low correlation between contact propensity and gene expression. To better understand the role of long-range interactions between distal regulatory elements during the early transformation from healthy colon to colorectal cancer, here we performed high resolution chromatin conformation capture for 33 samples including non-neoplastic mucosa, adenomatous polyps and adenocarcinomas, mostly from Familial Adenomatous Polyposis (FAP) patients. We identified hundreds of thousands of chromatin micro-structures, such as architectural stripes and loops, which originated from active cis-regulatory elements. Surprisingly, these structures progressively decayed throughout cancer progression, particularly at promoters. Meta-analyses revealed that this decay was independent of alterations in DNA methylation and chromatin accessibility. Interestingly, the degree of interaction loss was poorly correlated with gene expression changes. Instead, genes whose expression were disproportionately lower and higher than their relative promoter interaction in mucosa shifted their expression in polyps and adenocarcinomas to yield a more direct relationship between strength of interaction and gene expression. Our work provides the first high resolution 3D conformation maps during early cancer formation and progression, and provides novel insights into transcriptional readouts associated with fine-scale chromatin conformation alterations.