Abstract SARS-CoV-2 has infected over 160 million people and resulted in more than 3.3 million deaths, and we still face many challenges in the rollout of vaccines. Here, we use the high-density microarray patch to deliver a SARS-CoV-2 spike subunit vaccine directly to the skin. We show the vaccine, dry-coated on the patch is thermostable, and delivery of spike via HD-MAP induced greater cellular and antibody immune responses, with serum able to potently neutralize clinically relevant isolates including those from the B.1.1.7 and B.1.351 lineages. Finally, a single dose of HD-MAP-delivered spike provided complete protection from a lethal virus challenge, demonstrating that HD-MAP delivery of a SARS-CoV-2 vaccine is superior to traditional needle-and-syringe vaccination and has the potential to greatly impact the ongoing COVID-19 pandemic.

ABSTRACT Coronavirus disease-2019 (COVID-19) is primarily a respiratory disease, however, an increasing number of reports indicate that SARS-CoV-2 infection can also cause severe neurological manifestations, including precipitating cases of probable Parkinson’s disease. As microglial NLRP3 inflammasome activation is a major driver of neurodegeneration, here we interrogated whether SARS-CoV-2 can promote microglial NLRP3 inflammasome activation utilising a model of human monocyte-derived microglia. We identified that SARS-CoV-2 isolates can bind and enter microglia, triggering inflammasome activation in the absence of viral replication. Mechanistically, microglial NLRP3 could be both primed and activated with SARS-CoV-2 spike glycoprotein in a NF-κB and ACE2-dependent manner. Notably, virus- and spike protein-mediated inflammasome activation in microglia was significantly enhanced in the presence of α-synuclein fibrils, which was entirely ablated by NLRP3-inhibition. These results support a possible mechanism of microglia activation by SARS-CoV-2, which could explain the increased vulnerability to developing neurological symptoms akin to Parkinson’s disease in certain COVID-19 infected individuals, and a potential therapeutic avenue for intervention. SIGNIFICANCE STATEMENT Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) principally affects the lungs, however there is evidence that the virus can also reach the brain and lead to chronic neurological symptoms. In this study, we examined the interaction SARS-CoV-2 with brain immune cells, by using an ex-vivo model of human monocyte-derived microglia. We identified robust activation of the innate immune sensor complex, NLRP3 inflammasome, in cells exposed to SARS-CoV-2. This was dependent on spike protein-ACE2 receptor interaction and was potentiated in the presence of α-synuclein. We therefore identify a possible mechanism for SARS-CoV-2 and increased vulnerability to developing neurological dysfunction. These findings support a potential therapeutic avenue for treatment of SARS-CoV-2 driven neurological manifestations, through use of NLRP3 inflammasome or ACE2 inhibitors.

SUMMARY A recent study proposed severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hijacks the LINE-1 (L1) retrotransposition machinery to integrate into the DNA of infected cells. If confirmed, this finding could have significant clinical implications. Here, we applied deep (>50×) long-read Oxford Nanopore Technologies (ONT) sequencing to HEK293T cells infected with SARS-CoV-2, and did not find the virus integrated into the genome. By examining ONT data from separate HEK293T cultivars, we completely resolved 78 L1 insertions arising in vitro in the absence of L1 overexpression systems. ONT sequencing applied to hepatitis B virus (HBV) positive liver cancer tissues located a single HBV insertion. These experiments demonstrate reliable resolution of retrotransposon and exogenous virus insertions via ONT sequencing. That we found no evidence of SARS-CoV-2 integration suggests such events are, at most, extremely rare in vivo , and therefore are unlikely to drive oncogenesis or explain post-recovery detection of the virus.

Abstract Aging is the primary risk factor for most neurodegenerative diseases, and recently coronavirus disease 2019 (COVID-19) has been associated with severe neurological manifestations that can eventually impact neurodegenerative conditions in the long-term. The progressive accumulation of senescent cells in vivo strongly contributes to brain aging and neurodegenerative co-morbidities but the impact of virus-induced senescence in the aetiology of neuropathologies is unknown. Here, we show that senescent cells accumulate in physiologically aged brain organoids of human origin and that senolytic treatment reduces inflammation and cellular senescence; for which we found that combined treatment with the senolytic drugs dasatinib and quercetin rejuvenates transcriptomic human brain aging clocks. We further interrogated brain frontal cortex regions in postmortem patients who succumbed to severe COVID-19 and observed increased accumulation of senescent cells as compared to age-matched control brains from non-COVID-affected individuals. Moreover, we show that exposure of human brain organoids to SARS-CoV-2 evoked cellular senescence, and that spatial transcriptomic sequencing of virus-induced senescent cells identified a unique SARS-CoV-2 variant-specific inflammatory signature that is different from endogenous naturally-emerging senescent cells. Importantly, following SARS-CoV-2 infection of human brain organoids, treatment with senolytics blocked viral retention and prevented the emergence of senescent corticothalamic and GABAergic neurons. Furthermore, we demonstrate in human ACE2 overexpressing mice that senolytic treatment ameliorates COVID-19 brain pathology following infection with SARS-CoV-2. In vivo treatment with senolytics improved SARS-CoV-2 clinical phenotype and survival, alleviated brain senescence and reactive astrogliosis, promoted survival of dopaminergic neurons, and reduced viral and senescence-associated secretory phenotype gene expression in the brain. Collectively, our findings demonstrate SARS-CoV-2 can trigger cellular senescence in the brain, and that senolytic therapy mitigates senescence-driven brain aging and multiple neuropathological sequelae caused by neurotropic viruses, including SARS-CoV-2.

Abstract The SARS-CoV2 Omicron variant sub-lineages spread rapidly through the world, mostly due to their immune-evasive properties. This has put a significant part of the population at risk for severe disease and underscores the need for anti-SARS-CoV-2 agents that are effective against emergent strains in vulnerable patients. Camelid nanobodies are attractive therapeutic candidates due to their high stability, ease of large-scale production and potential for delivery via inhalation. Here, we characterize the RBD-specific nanobody W25, which we previously isolated from an alpaca, and show superior neutralization activity towards Omicron lineage BA.1 in comparison to all other SARS-CoV2 variants. Structure analysis of W25 in complex with the SARS-CoV2 spike surface glycoprotein shows that W25 engages an RBD epitope not covered by any of the antibodies previously approved for emergency use. Furthermore, we show that W25 also binds the spike protein from the emerging, more infectious Omicron BA.2 lineage with picomolar affinity. In vivo evaluation of W25 prophylactic and therapeutic treatments across multiple SARS-CoV-2 variant infection models, together with W25 biodistribution analysis in mice, demonstrates favorable pre-clinical properties. Together, these data endorse prioritization of W25 for further clinical development.

Migraine is a severe and chronic neurological disorder that affects ~18% of people worldwide, the majority being female (3:1). It is characterized by recurrent, debilitating headaches and heightened sensory sensitivities. People with migraine may also experience a heightened motion sensitivity that leads to episodes of vertigo and imbalance, termed vestibular migraine (VM). Calcitonin gene-related peptide (CGRP) is implicated in migraine and is believed to act on brain meninges or in subcortical CNS structures, and CGRP-based antagonists have shown efficacy for migraine treatment. CGRP also signals at efferent synapses of the cochlea and vestibular endorgans, but it is unclear if exogenous CGRP can modulate inner ear function at the endorgan level and cause heightened behavioral responses consistent with VM. We tested if intraperitoneally (IP) delivered CGRP to wildtype mice can modulate endorgan potentials to sound [via auditory brainstem responses (ABRs)] and jerk stimuli [via vestibular sensory evoked potentials (VsEPs)]. We also assessed behavioral measures of phonophobia [acoustic startle reflex (ASR)] and static imbalance [postural sway-center of pressure (CoP)] after IP CGRP, and observed female mice exhibited heightened sensitivities to IP CGRP in all assays. Male mice showed similar auditory sensitivity and endorgan effects to CGRP, but systemic CGRP did not modify male postural sway as it did in females. In conclusion, we show that systemically delivered CGRP modulates activity of the auditory and vestibular endorgan responses and elicits behavioral effects that are consistent with symptoms in a disorder like VM.

Abstract Gerromorpha Popov, 1971 is a fascinating and diverse insect lineage that evolved about 200 Mya to spend their entire life cycle on the air–water interface and have since colonized all types of aquatic habitats. The subfamily Halobatinae Bianchi, 1896 is particularly interesting because some species have adapted to life on the open ocean—a habitat where insects are very rarely found. Several attempts have been made to reconstruct the phylogenetic hypotheses of this subfamily, but the use of a few partial gene sequences recovered only a handful of well-supported relationships, thus limiting evolutionary inferences. Fortunately, the emergence of high-throughput sequencing technologies has enabled the recovery of more genetic markers for phylogenetic inference. We applied genome skimming to obtain mitochondrial and nuclear genes from low-coverage whole-genome sequencing of 85 specimens for reconstructing a well-supported phylogeny, with particular emphasis on Halobatinae. Our study confirmed that Metrocorini Matsuda, 1960, is paraphyletic, whereas Esakia Lundblad, 1933, and Ventidius Distant, 1910, are more closely related to Halobatini Bianchi, 1896, than Metrocoris Mayr, 1865, and Eurymetra Esaki, 1926. We also found that Ventidius is paraphyletic and in need of a taxonomic revision. Ancestral state reconstruction suggests that Halobatinae evolved progressively from limnic to coastal habitats, eventually attaining a marine lifestyle, especially in the genus Halobates Eschscholtz, 1822, where the oceanic lifestyle evolved thrice. Our results demonstrate that genome skimming is a powerful and straightforward approach to recover genetic loci for robust phylogenetic analysis in non-model insects.

Abstract The emergence of SARS-CoV-2 variants alters the efficacy of existing immunity towards the viral spike protein, whether acquired from infection or vaccination. Mutations that impact N -glycosylation of spike may be particularly important in influencing antigenicity, but their consequences are difficult to predict. Here, we compare the glycosylation profiles and antigenicity of recombinant viral spike of ancestral Wu-1 and the Gamma strain, which has two additional N -glycosylation sites due to amino acid substitutions in the N-terminal domain (NTD). We found that a mutation at residue 20 from threonine to asparagine within the NTD caused the loss of NTD-specific antibody binding. Glycan site-occupancy analyses revealed that the mutation resulted in N -glycosylation switching to the new sequon at N20 from the native N17 site. Site-specific glycosylation profiles demonstrated distinct glycoform differences between Wu-1, Gamma, and selected NTD variant spike proteins, but these did not affect antibody binding. Finally, we evaluated the specificity of spike proteins against convalescent COVID-19 sera and found reduced cross-reactivity against some mutants, but not Gamma spike compared to Wuhan spike. Our results illustrate the impact of viral divergence on spike glycosylation and SARS-CoV-2 antibody binding profiles.