Essential gene functions underpin the core reactions required for cell viability, but their contributions and relationships are poorly studied in vivo. Using CRISPR interference, we created knockdowns of every essential gene in Bacillus subtilis and probed their phenotypes. Our high-confidence essential gene network, established using chemical genomics, showed extensive interconnections among distantly related processes and identified modes of action for uncharacterized antibiotics. Importantly, mild knockdown of essential gene functions significantly reduced stationary-phase survival without affecting maximal growth rate, suggesting that essential protein levels are set to maximize outgrowth from stationary phase. Finally, high-throughput microscopy indicated that cell morphology is relatively insensitive to mild knockdown but profoundly affected by depletion of gene function, revealing intimate connections between cell growth and shape. Our results provide a framework for systematic investigation of essential gene functions in vivo broadly applicable to diverse microorganisms and amenable to comparative analysis.

Abstract The spatiotemporal structure of the human microbiome and metabolome reflects and determines regional intestinal physiology and may have implications for disease. Yet, we know little about the distribution of microbes and their products in the gut because of reliance on stool samples and limited access only to some regions of the gut using endoscopy in fasting or sedated individuals. To address these deficiencies, we developed and evaluated a safe, ingestible device that collects samples from multiple regions of the human intestinal tract during normal digestion. The collection of 240 intestinal samples from 15 healthy individuals using the device revealed significant differences between microbes and metabolites present in the intestines versus stool. Certain microbial taxa were differentially enriched, and bile acid profiles varied along the intestines and were highly distinct from those of stool. Correlations between gradients in bile acid concentrations and microbial abundance predicted species that altered the bile acid pool through deconjugation. Overall, we identified heterogeneous intestinal profiles of bacterial taxa and metabolites indicating that non-invasive multi-regional sampling of the intestinal tract under physiological conditions can help elucidate the roles of the gut microbiome and metabolome in human physiology and disease.

Abstract Fluctuating conditions and diverse stresses are typical in natural environments. In response, cells mount complex responses across multiple scales, including adjusting their shape to withstand stress. In enterobacteria, the Rcs phosphorelay is activated by cell envelope damage and by changes to periplasmic dimensions and cell width. Here, we investigated the physiological and morphological consequences of Rcs activation in Escherichia coli in the absence of stresses, using an inducible version of RcsF that mislocalizes to the inner membrane, RcsF IM . Expression of RcsF IM immediately reduced cellular growth rate and the added length per cell cycle in a manner that was directly dependent on induction levels, but independent of Rcs-induced capsule production. At the same time, cells increased intracellular concentration of the cell division protein FtsZ, and decreased the distance between division rings in filamentous cells. Depletion of the Rcs negative regulator IgaA phenocopied RcsF IM induction, indicating that IgaA is essential due to growth inhibition in its absence. However, A22 treatment did not affect growth rate or FtsZ intracellular concentration, despite activating the Rcs system. These findings suggest that the effect of Rcs activation on FtsZ levels is mediated indirectly through growth-rate changes, and highlight feedbacks among the Rcs stress response, growth dynamics, and cell-size control.

ABSTRACT Much remains to be explored regarding the diversity of uncultured, host-associated microbes. Here, we report the discovery of unusual rectangular bacterial structures (RBSs) in the mouths of bottlenose dolphins. DNA staining revealed multiple paired bands within RBSs that suggested cells dividing along the longitudinal axis. Cryogenic transmission electron microscopy and tomography revealed parallel membrane-bound segments, suspected to be cells, encapsulated by an S-layer-like periodic surface covering. RBSs displayed novel pilus-like appendages with bundles of threads splayed at the tips. Multiple lines of evidence suggested that RBSs are bacterial and distinct from the Neisseriaceae genera Simonsiella and Conchiformibius , with which they share similar morphology and division patterning, including genomic DNA sequencing of micromanipulated RBSs, 16S rRNA gene sequencing, and fluorescence in situ hybridization. Our findings highlight the diversity of novel microbial forms and lifestyles that await discovery and characterization using tools complementary to genomics such as microscopy.

Abstract Bacterial growth in nutrient-rich and starvation conditions is intrinsically tied to the environmental history and physiological state of the population. While high-throughput technologies have enabled rapid analyses of mutant libraries, technical and biological challenges complicate data collection and interpretation. Here, we present a framework for the execution and analysis of growth measurements with improved accuracy over standard approaches. Using this framework, we demonstrate key biological insights that emerge from consideration of culturing conditions and history. We determined that quantification of the background absorbance in each well of a multi-well plate is critical for accurate measurements of maximal growth rate. Using mathematical modeling, we demonstrated that maximal growth rate is dependent on initial cell density, which distorts comparisons across strains with variable lag properties. We established a multiple-passage protocol that alleviates the substantial effects of glycerol on growth in carbon-poor media, and we tracked growth rate-mediated fitness increases observed during a long-term evolution of Escherichia coli in low glucose concentrations. Finally, we showed that growth of Bacillus subtilis in the presence of glycerol induces a long lag in the next passage due to inhibition of a large fraction of the population. Transposon mutagenesis linked this phenotype to the incorporation of glycerol into lipoteichoic acids, revealing a new role for these envelope components in resuming growth after starvation. Together, our investigations underscore the complex physiology of bacteria during bulk passaging and the importance of robust strategies to understand and quantify growth. Abstract Importance How starved bacteria adapt to and multiply in replete nutrient conditions is intimately linked to their history of previous growth, their physiological state, and the surrounding environment. While automated equipment has enabled high-throughput growth measurements, data interpretation and knowledge gaps regarding the determinants of growth kinetics complicate comparisons between strains. Here, we present a framework for growth measurements that improves accuracy and attenuates the effects of growth history. We determined that background absorbance quantification and multiple passaging cycles allows for accurate growth-rate measurements even in carbon-poor media, which we used to reveal growth-rate increases during long-term laboratory evolution of Escherichia coli . Using mathematical modeling, we showed that maximum growth rate depends on initial cell density. Finally, we demonstrated that growth of Bacillus subtilis with glycerol inhibits the future growth of most of the population, due to lipoteichoic-acid synthesis. These studies highlight the challenges of accurate quantification of bacterial growth behaviors.

While cytoskeletal proteins in the actin family are structurally similar, as filaments they act as critical components of diverse cellular processes across all kingdoms of life. In many rod-shaped bacteria, the actin homolog MreB directs cell-wall insertion and maintains cell shape, but it remains unclear how structural changes to MreB affect its physiological function. To bridge this gap, we performed molecular dynamics simulations for Caulobacter crescentus MreB and then utilized a coarse-grained biophysical model to successfully predict MreB filament properties in vivo. We discovered that MreB double protofilaments exhibit left-handed twisting that is dependent on the bound nucleotide and membrane binding; the degree of twisting determines the limit length and orientation of MreB filaments in vivo. Membrane binding of MreB also induces a stable membrane curvature that is physiologically relevant. Together, our data empower the prediction of cytoskeletal filament size from molecular dynamics simulations, providing a paradigm for connecting protein filament structure and mechanics to cellular functions.

Abstract Background Cellular senescence features irreversible growth arrest and secretion of multiple proinflammatory cytokines. Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) detects DNA damage and activates the DNA-sensing pathway, resulting in the upregulation of inflammatory genes and induction of cellular senescence. This study aimed to investigate the effect of cGAS in regulating senescence of nucleus pulposus (NP) cells under inflammatory microenvironment. Methods The expression of cGAS was evaluated by immunohistochemical staining in rat intervertebral disc (IVD) degeneration model induced by annulus stabbing. NP cells were harvested from rat lumbar IVD and cultured with 10ng/ml IL-1β for 48 h to induce premature senescence. cGAS was silenced by cGAS specific siRNA in NP cells and cultured with IL-1β. Cellular senescence was evaluated by senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal) staining and flow cytometry. The expression of senescence-associated secretory phenotype including IL-6, IL-8, and TNF-a was evaluated by ELISA and western blotting. Results cGAS was detected in rat NP cells in cytoplasm and the expression was significantly increased in degenerated IVD. Culturing in 10ng/ml IL-1β for 48 h induced cellular senescence in NP cells with attenuation of G1-S phase transition. In senescent NP cells the expression of cGAS, p53, p16, NF-kB, IL-6, IL-8, TNF-α was significantly increased while aggrecan and collagen type II was reduced than in normal NP cells. In NP cells with silenced cGAS, the expression of p53, p16, NF-kB, IL-6, IL-8, and TNF-α was reduced in inflammatory culturing with IL-1β. Conclusion cGAS was increased by NP cells in degenerated IVD promoting cellular senescence and senescent inflammatory phenotypes. Targeting cGAS may alleviate IVD degeneration by reducing NP cell senescence.

Abstract The Rcs signal transduction system is a phosphorelay responsible for sensing a wide variety of enterobacterial cell envelope stresses. In Escherichia coli , the Rcs system is required to survive A22 and mecillinam treatment, two drugs that perturb cell size. To test whether cell size changes might be correlated with envelope damage and thereby sensed by the Rcs system, we tuned E. coli cell size via drug inhibition with A22, point mutations to the cell-shape determinant MreB, and mechanically confined growth. In all conditions, cell width was strongly correlated with Rcs activation, with wider cells exhibiting more activation than wild-type. In all conditions, RcsF, the outer membrane-localized upstream component of the Rcs system, was essential for responding to cell width changes. Consistently, several envelope gene deletions known to induce the Rcs system via RcsF resulted in cells that were wider than wild-type. Cryo- electron microscopy revealed that the periplasm of a wide MreB mutant was on average ∼3 nm thinner than wild-type, thereby bringing RcsF closer to the downstream components of the signaling cascade in the inner membrane. Conversely, extending the flexible linker region of RcsF by ∼3 nm increased Rcs activity in wild-type cells. In summary, we propose that the Rcs system responds to changes in cell width because of altered periplasmic thickness.

ABSTRACT Chronic systolic heart failure (HF) is a prevalent and morbid disease with marked variability in its progression and response to therapies. The gut microbiome may play a role in pathophysiology and progression of chronic HF, but clinical studies investigating relationships between the two are lacking. We analyzed the gut microbiome in a cohort of adults with chronic systolic HF caused by non-ischemic cardiomyopathy ( n =59) using multi-omics profiling and, in some cases, longitudinal sampling. We identified microbiome differences compared to healthy subjects ( n =50) and associated these differences with host metabolites, inflammatory markers and physiology. We found depletion of the anti-inflammatory probiotic Bifidobacterium and the associated short chain fatty acid producing and formaldehyde detoxifying pathways in the chronic HF cohort. We also discovered HF-specific microbiome-host immunome interactions. In addition to identifying several taxa and microbial pathways broadly associated with HF disease severity, we found significant links between Bifidobacterium and clinical HF improvement over time. Gut microbiome-host multi-omic data integration revealed a close association between Bifidobacterium and circulating metabolites previously implicated in cardiovascular physiology (e.g., malonic acid), thus pointing to potential mechanisms through which Bifidobacterium may affect chronic HF physiology. Our results suggest that Bifidobacterium may serve as a biomarker for chronic HF trajectory as well as suggest potential novel therapeutic interventions strategies.

Human gut commensal bacteria are routinely exposed to various stresses, including therapeutic drugs, and collateral effects are difficult to predict. To systematically interrogate community-level effects of drug perturbations, we screened stool-derived