Abstract Advances in singe-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have made possible to solve the structures of numerous Family A and Family B G protein coupled receptors (GPCRs) in complex with G proteins and arrestins, as well as several Family C GPCRs. Determination of these structures has been facilitated by the presence of large extra-membrane components (such as G protein, arrestin, or Venus flytrap domains) in these complexes that aid in particle alignment during processing of the cryo-EM data. In contrast, determination of the inactive state structure of Family A GPCRs is more challenging due to the relatively small size of the seven transmembrane domain (7TM) and to the surrounding detergent micelle that, in the absence of other features, make particle alignment impossible. Here we describe an alternative protein engineering strategy where the heterodimeric protein calcineurin is fused to a GPCR by three points of attachment, the cytoplasmic ends of TM5, TM6 and TM7. This three-point attachment provides a more rigid link with the GPCR transmembrane domain that facilitates particle alignment during data processing, allowing us to determine the structures of the β 2 adrenergic receptor (β 2 AR) in the apo, antagonist-bound, and agonist-bound states. We expect that this fusion strategy may have broad application in cryo-EM structural determination of other Family A GPCRs.

Abstract Drugs targeting the G protein-coupled μ-opioid receptor (μOR) are the most effective analgesics available but are also associated with fatal respiratory depression. While some partial opioid agonists appear to be safer than full agonists, the signaling pathways responsible for respiratory depression have yet to be elucidated. Here we investigated the structural and mechanistic basis of action of lofentanil (LFT) and mitragynine pseudoindoxyl (MP), two μOR agonists with different safety profiles. LFT, one of the most potent and lethal opioids, and MP, a derivative from the kratom plant with reduced respiratory depression in animal studies at equianalgesic doses, exhibited markedly different signaling efficacy profiles for G protein subtype activation and recruitment of β-arrestins. Cryo-EM structures of the μOR-Gi1 complex with MP (2.5Å) and LFT (3.2Å) revealed that the two ligands engage distinct sub-pockets, and molecular dynamics (MD) simulations showed additional differences in the binding site that propagate to the intracellular side of the receptor where G proteins and β-arrestins bind. While MP favors the precise G protein-bound active state observed in the cryo-EM structures, LFT favors a distinct active state. These results highlight how drugs engaging different parts of the μOR orthosteric pocket can lead to distinct signaling outcomes.

Abstract Metabotropic glutamate receptors belong to a family of G protein-coupled receptors that are obligate dimers and possess a large extracellular ligand-binding domain (ECD) that is linked via a cysteine-rich domain (CRDs) to their 7-transmembrane (TM) domain. Upon activation, these receptors undergo a large conformational change to transmit the ligand binding signal from the ECD to the G protein-coupling TM. In this manuscript, we propose a model for a sequential, multistep activation mechanism of metabotropic glutamate receptor subtype 5. We present a series of structures in lipid nanodiscs, from inactive to fully active, including agonist-bound intermediate states. Further, using bulk and single-molecule fluorescence imaging we reveal distinct receptor conformations upon allosteric modulator and G protein binding.

G protein coupled receptors (GPCRs) exhibit varying degrees of selectivity for different G protein isoforms. Despite the abundant structures of GPCR-G protein complexes, little is known about the mechanism of G protein coupling specificity. The β2-adrenergic receptor is an example of GPCR with high selectivity for Gαs, the stimulatory G protein for adenylyl cyclase, and much weaker for the Gαi family of G proteins inhibiting adenylyl cyclase. By developing a new Gαi-biased agonist (LM189), we provide structural and biophysical evidence supporting that distinct conformations at ICL2 and TM6 are required for coupling of the different G protein subtypes Gαs and Gαi. These results deepen our understanding of G protein specificity and bias and can accelerate the design of ligands that select for preferred signaling pathways.

Abstract The μ-opioid receptor (μOR) is the major target for opioid analgesics. Activation of μOR initiates signaling through G protein pathways as well as through β-arrestin recruitment. μOR agonists that are biased towards G protein signaling pathways demonstrate diminished side effects. PZM21, discovered by computational docking, is a G protein biased μOR agonist. Here we report the cryoEM structure of PZM21 bound μOR in complex with G i protein. Structure-based evolution led to multiple PZM21 analogs with more pronounced G i protein bias and increased lipophilicity to improve CNS penetration. Among them, FH210 shows extremely low potency and efficacy for arrestin recruitment. We further determined the cryoEM structure of FH210 bound to μOR in complex with G i protein and confirmed its expected binding pose. The structural and pharmacological studies reveal a potential mechanism to reduce β-arrestin recruitment by the μOR, and hold promise for developing next-generation analgesics with fewer adverse effects. Table of Contents Graphical Abstract We obtained cryoEM structures of the μ-opioid receptor (μOR) bound to the lead compound PZM21 and the newly developed agonist FH210 to understand the mechanism of their biased signaling and to guide the evolution of next-generation analgesics with fewer adverse effects.

Abstract Endocannabinoids (eCBs) are endogenous lipid molecules that activate the cannabinoid receptor 1 (CB1), a G protein coupled receptor (GPCR) that signals primarily through the G i/o family of G proteins to regulate neurotransmitter release. Consequently, CB1 is an important therapeutic target for several neurological disorders. How eCBs interact with CB1 is not known and the downstream signaling they activate is not well understood. In this study we show that eCBs do not activate G i 1 as much as synthetic cannabinoids. To characterize activation of CB1 by eCB, we formed an eCB analogue-bound (AMG315) CB1-G i signaling complex for structural studies. The structure reveals differences in the orthosteric ligand binding pocket not seen in the previous CB1 structures, providing insights into the structural determinants of ligand efficacy. In combination with signaling and simulation data, this study provides mechanistic insights into CB1 activation by different classes of ligands, and sheds light on the G protein preferences between endogenous and exogenous ligands.

Abstract Nosema ceranae is an emergent microsporidia parasite of the European honey bee ( Apis mellifera ), which causes serious nosemosis implicated in honeybee colony losses worldwide. N. ceranae is an obligate intracellular eukaryotic parasite that mainly invades the midgut of honeybees. Recent studies find that bee gut microbiota is potentially involved in protecting against parasitism. Here, using laboratory-generated bees mono-associated with gut members, we find that Snodgrassella alvi inhibited microsporidia proliferation, potentially via the stimulation of host oxidant-mediated immune response. Accordingly, N. ceranae employs the thioredoxin and glutathione systems to defend against oxidative stress and maintain a balanced redox equilibrium, which is essential for the infection process. We knocked down the gene expression using nanoparticle-mediated RNA interference, which targets the γ-glutamyl-cysteine synthetase and thioredoxin reductase genes of microsporidia. It significantly reduces the spore load, confirming the importance of the antioxidant mechanism for the intracellular invasion of the N. ceranae parasite. Finally, we genetically modified the symbiotic S. alvi to deliver dsRNA corresponding to the genes involved in the redox system of the microsporidia. The engineered S. alvi induces RNA interference and represses parasite gene expression, thereby inhibits the parasitism by up to 99.8%. Specifically, N. ceranae was most suppressed by the recombinant strain corresponding to the glutathione synthetase or by a mixture of bacteria expressing variable dsRNA. Our findings extend our previous understanding of the protection of gut symbionts against N. ceranae and provide a symbiont-mediated RNAi system for inhibiting microsporidia infection in honeybees.

Current influenza vaccines do not elicit broadly protective immune responses against multiple strains. New strategies to focus the humoral immune response to conserved regions on influenza antigens are therefore required for recognition by broadly neutralizing antibodies. It has been suggested that B cells with receptors that recognize conserved epitopes would be preferentially stimulated through avidity effects by mosaic particles presenting multiple forms of a variable antigen. We adapted SpyCatcher-based platforms, AP205 virus-like particles (VLPs) and mi3 nanoparticles (NPs), to covalently co-display SpyTagged hemagglutinin (HA) trimers from different influenza strains. Here we show successful homotypic and heterotypic conjugation of up to 8 different HA trimers to both VLPs and NPs, and demonstrate that conjugated particles were stable for several weeks of storage. We characterized the HA-VLPs and HA-NPs by cryo-electron tomography to derive the average number of conjugated HAs and their separation distances, and compared immunizations of mosaic and homotypic particles in wild-type mice. Both types of HA particles elicited strong antibody responses, but the mosaic particles did not consistently elicit broader immune responses. We conclude that covalent attachment of HAs from currently-circulating influenza strains represents a viable alternative to current annual influenza vaccine strategies, but in the absence of further modifications, is unlikely to represent a method for making a universal influenza vaccine.

Abstract The µ-opioid receptor (µOR) is a well-established target for analgesia, yet conventional opioid receptor agonists cause serious adverse effects, notably addiction and respiratory depression, which have led to the present opioid overdose epidemic. µOR negative allosteric modulators (NAMs) may serve as powerful tools in preventing opioid overdose deaths, but promising chemical scaffolds remain elusive. We screened a large DNA-encoded chemical library against inactive µOR, counter-screening with active, G-protein and agonist bound receptor to “steer” selections toward functional negative allosteric modulators. We discovered a NAM compound with high and selective enrichment to inactive µOR; the molecule potently blocks the activity of orthosteric agonists and enhances the affinity of the key opioid overdose reversal molecule, naloxone. It accomplishes this by binding to a site on the extracellular vestibule proximal to naloxone, stabilizing a unique inactive conformation of the extracellular portions of the second and seventh transmembrane helices. The NAM perturbs orthosteric ligand kinetics in therapeutically desirable ways and works cooperatively with low doses of naloxone in vivo to inhibit morphine-induced antinociception, respiratory depression and conditioned place preference while minimizing withdrawal behaviors. Our results provide detailed structural insights into the mechanism of a negative allosteric modulator for the µOR and demonstrate how it can be exploited in vivo .