Abstract Lymphatic vessels are indispensable for tissue fluid homeostasis, transport of solutes and dietary lipids and immune cell trafficking. In contrast to blood vessels, which are easily visible by their erythrocyte cargo, lymphatic vessels are not readily detected in the tissue context. Their invisibility interferes with the analysis of the three-dimensional lymph vessel structure in large tissue volumes and hampers dynamic intravital studies on lymphatic function and pathofunction. An approach to overcome these limitations are mouse models, which express transgenic fluorescent proteins under the control of tissue-specific promotor elements. We introduce here the BAC-transgenic mouse reporter strain Vegfr3 -tdTomato that expresses a membrane-tagged version of tdTomato under control of Flt4 regulatory elements. Vegfr3 -tdTomato mice inherited the reporter in a mendelian fashion and showed selective and stable fluorescence in the lymphatic vessels of multiple organs tested, including lung, kidney, heart, diaphragm, intestine, mesentery and dermis. In this model, tdTomato expression was sufficient for direct visualisation of lymphatic vessels by epifluorescence microscopy. Furthermore, lymph vessels were readily visualized using a number of microscopic modalities including confocal laser scanning, light sheet fluorescence and two-photon microscopy. Due to the early onset of VEGFR-3 expression in venous embryonic vessels and the short maturation time of tdTomato, this reporter offers an interesting alternative to Prox1-promoter driven lymphatic reporter mice for instance to study the developmental differentiation of venous to lymphatic endothelial cells.

Abstract During embryogenesis, endothelial cells (ECs) are generally described to arise from a common pool of progenitors termed angioblasts, which diversify through iterative steps of differentiation to form functionally distinct subtypes of ECs. A key example is the formation of lymphatic ECs (LECs), which are thought to arise largely through transdifferentiation from venous endothelium. Opposing this model, here we show that the initial expansion of mammalian LECs is primarily driven by the in situ differentiation of mesenchymal progenitors and does not require transition through an intermediate venous state. Single-cell genomics and lineage-tracing experiments revealed a population of paraxial mesoderm-derived Etv2 + Prox1 + progenitors that directly give rise to LECs. Morphometric analyses of early LEC proliferation and migration, and mutants that disrupt lymphatic development supported these findings. Collectively, this work establishes a cellular blueprint for LEC specification and indicates that discrete pools of mesenchymal progenitors can give rise to specialized subtypes of ECs.

Abstract The lymphatic vasculature is essential for tissue fluid homeostasis, immune cell surveillance and dietary lipid absorption, and has emerged as a key regulator of organ growth and repair 1 . Despite significant advances in our understanding of lymphatic function, the precise developmental origin of lymphatic endothelial cells (LECs) has remained a point of debate for over a century 2-5 . It is currently widely accepted that most LECs are derived from venous endothelium 4,6 , although other sources have been described, including mesenchymal cells 3 , hemogenic endothelium 7 and musculoendothelial progenitors 8,9 . Here we show that the initial expansion of mammalian LECs is driven primarily by the in situ differentiation of specialized angioblasts and not migration from venous endothelium. Single-cell RNA sequencing and genetic lineage tracing experiments in mouse revealed a population of Etv2 + Prox1 + lymphangioblasts that arise directly from paraxial mesoderm-derived progenitors. Conditional lineage labelling and morphological analyses showed that these specialized angioblasts emerge within a tight spatiotemporal window, and give rise to LECs in numerous tissues. Analysis of early LEC proliferation and migration supported these findings, suggesting that emergence of LECs from venous endothelium is limited. Collectively, our data reconcile discrepancies between previous studies and indicate that LECs form through both de novo specification from lymphangioblasts and transdifferentiation from venous endothelium.

Abstract Lymphatic vessels (LVs) are indispensable for tissue fluid homeostasis and immune cell trafficking. The network of LVs that channel fluids from the gut into mesenteric lymph nodes (MLN) has been recognized as the sole lymphatic system in the mesentery. Here we describe an alternative, functionally autonomous set of capillary mesenteric LVs (capMLVs) that by-pass the MLNs and drain directly into mediastinal LNs. CapMLVs develop perinatally from valves of collective mesenteric lymphatic vessels (colMLVs) in response to arterial endothelial cell-derived VEGF-C. Once extended, capMLVs detach from colMLVs to form an independent elongated network comprised of LYVE1+, CCL21+ endothelial cells. Avascular areas of the mesentery juxtaposed to capMLVs contain cell islets that express ACKR4. This CCL21-scavenging atypical receptor facilitates the migration of mesenteric phagocytes into capMLVs to be channeled directly into mediastinal LNs. This allows peritoneum-derived ominous antigens to be processed separately from alimentary antigens.

Abstract Despite a growing catalogue of secreted factors critical for lymphatic network assembly, little is known about the mechanisms that modulate the expression level of these molecular cues in blood vascular endothelial cells (BECs). Here, we show that a BEC-specific transcription factor, SOX7, plays a crucial role in lymphatic vessel patterning by modulating the transcription of lymphangiocrine signals. While SOX7 is not expressed in lymphatic endothelial cells (LECs), loss of SOX7 function in mouse embryos causes a dysmorphic dermal lymphatic phenotype. We identify novel distant regulatory regions in mice and humans that contribute to directly repressing the transcription of a major lymphangiogenic growth factor ( Vegfc ) in a SOX7-dependent manner. Further, we show that SOX7 directly binds HEY1, a canonical repressor of the Notch pathway, suggesting that transcriptional repression may also be modulated by the recruitment of this protein partner at Vegfc genomic regulatory regions. Our work unveils a role for SOX7 in modulating downstream signalling events crucial for lymphatic patterning, at least in part via the transcriptional repression of VEGFC levels in the blood vascular endothelium.