Abstract Aberrations in nuclear size and shape are commonly used to identify cancerous tissue. However, it remains unclear whether the disturbed nuclear structure directly contributes to the cancer pathology or is merely a consequence of other events occurring during tumorigenesis. Here, we show that highly invasive and proliferative breast cancer cells frequently exhibit Akt-driven lower expression of the nuclear envelope proteins lamin A/C, leading to increased nuclear deformability that permits enhanced cell migration through confined environments that mimic interstitial spaces encountered during metastasis. Importantly, increasing lamin A/C expression in highly invasive breast cancer cells reflected gene expression changes characteristic of human breast tumors with higher LMNA expression, and specifically affected pathways related to cell-ECM interactions, cell metabolism, and PI3K/Akt signaling. Further supporting an important role of lamins in breast cancer metastasis, analysis of lamin levels in human breast tumors revealed a significant association between lower lamin A levels, Akt signaling, and decreased disease-free survival. These findings suggest that downregulation of lamin A/C in breast cancer cells may influence both cellular physical properties and biochemical signaling to promote metastatic progression.

Abstract Tumor progression is accompanied by fibrosis, which is associated with diminished anti-tumor immune infiltrate. Here, we demonstrate that tumor infiltrating myeloid cells respond to the stiffened fibrotic tumor microenvironment (TME) by initiating a TGF-beta (TGFβ)-directed, collagen biosynthesis program. A collateral effect of this programming is an untenable metabolic milieu for productive CD8 T cell anti-tumor responses, as collagen-synthesizing macrophages consume environmental arginine, synthesize proline, and secrete ornithine that compromises CD8 + T cell function. Thus, a stiff and fibrotic TME may impede anti-tumor immunity not only by direct physical exclusion of CD8 + T cells, but also via secondary effects of a myeloid mechano-metabolic programming we identified that creates an inhospitable metabolic milieu for CD8 + T cells.

Toll-like receptor (TLR)-dependent macrophage responses rely on acute increases in oxidative mitochondrial glucose metabolism that epigenetically support rapid proinflammatory transcriptional programming via histone acetylation. Subsequent suppression of oxidative metabolism restrains this metabolic-epigenetic support of proinflammatory gene transcription to enforce tolerance, an immunosuppressed state of innate immune memory. Identifying biology that promotes or counters these metabolic-epigenetic changes will inform therapeutic approaches to influence proinflammatory, antimicrobial, and immunosuppressed myeloid cellular states. Here, we demonstrate that Coenzyme A (CoA) is a ″ metabolic adjuvant ″, as supplying exogenous CoA to macrophages both enhances the magnitude of TLR-driven proinflammatory and antimicrobial responses, and reverse tolerance, via promotion of oxidative metabolism. Extracellular CoA, which we isotopically trace to show its direct uptake by macrophages, works synergistically with tonic TLR signaling, which we demonstrate is a critical regulator of nutrient uptake, metabolism, histone acetylation, and gene expression in macrophages. Together, TLR signaling and exogenous CoA promote mitochondrial glucose oxidation, acetyl-CoA production, and TLR target gene-specific histone acetylation, enhancing metabolic-epigenetic support of proinflammatory transcriptional programming. Exogenous CoA unlocks tumor-associated macrophage (TAM)-dependent TLR agonist anti-tumor activity in an in vivo breast cancer model, and promotes macrophage restriction of the intracellular bacterial pathogen Legionella pneumophila in vitro via an Irg1-dependent antimicrobial state of CoA-augmented itaconate biosynthesis. Our findings demonstrate direct acquisition of intact extracellular CoA, and the ability of this exogenously supplemented metabolic cofactor to augment a key oxidative metabolic-epigenetic pathway supporting proinflammatory and antimicrobial macrophage phenotypes. This may inform host-targeted metabolic adjuvant therapies to reverse myeloid immunosuppression.

Abstract Primary tissue organoids and cell spheroids recapitulate tissue physiology with remarkable fidelity. We investigated how engagement with a three dimensional laminin-rich extracellular matrix supports the polarized, stress resilient spheroid phenotype of mammary epithelial cells. Cells within a three dimensional laminin-rich extracellular matrix decreased and redistributed the actin crosslinker filamin to reduce their cortical actin tension. Cells with low cortical actin tension had increased plasma membrane protrusions that promoted negative plasma membrane curvature and fostered protein associations with the plasma membrane, consistent with efficient protein secretion. By contrast, cells engaging a laminin-rich extracellular matrix in two dimensions had high filamin-dependent cortical actin tension, exhibited compromised endoplasmic reticulum function including increased expression of PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase signaling effectors, and had compromised protein secretion. Cells with low filamin-mediated cortical actin tension and reduced endoplasmic reticulum stress response signaling secreted, and assembled, a polarized endogenous basement membrane and survived better, and their spheroids were more resistant to exogenous stress. The findings implicate filamin-dependent cortical actin tension in endoplasmic reticulum function and highlight a role for mechanics in organoid homeostasis.

Abstract Targeted protein degradation is an emerging strategy for the elimination of classically undruggable proteins. Here, to expand the landscape of substrates that can be selectively degraded, we designed degraders which are dependent on both peptide sequence and glycosylation status of the target protein. We applied this approach to mucins, O-glycosylated proteins that drive cancer progression through biophysical and immunological mechanisms. Engineering of a bacterial mucin-selective protease yielded a variant for fusion to a cancer antigen-binding nanobody. The resulting conjugate selectively degraded mucins on cancer cells, promoted cell death in culture models of mucin-driven growth and survival, and reduced tumor growth in murine models of breast cancer progression. This work establishes a blueprint for the development of biologics which degrade specific glycoforms of cell surface proteins.

The construction of three-dimensional (3D) microvascular networks with defined structures remains challenging. Emerging bioprinting strategies provide a means of patterning endothelial cells (ECs) into the geometry of 3D microvascular networks, but the microenvironmental cues necessary to promote their self-organization into cohesive and perfusable microvessels are unknown. To this end, we reconstituted microvessel formation in vitro by patterning thin lines of closely packed ECs fully embedded within a 3D extracellular matrix (ECM) and observed how different microenvironmental parameters influenced EC behaviors and their self-organization into microvessels. We found that the inclusion of fibrillar matrices, such as collagen I, into the ECM positively influenced cell condensation into extended geometries such as cords. We also identified the presence of a high molecular weight protein(s) in fetal bovine serum (FBS) that negatively influenced EC condensation. This component destabilized cord structure by promoting cell protrusions and destabilizing cell-cell adhesions. Endothelial cords cultured in the presence of fibrillar collagen and the absence of this protein activity were able to polarize, lumenize, incorporate mural cells, and support fluid flow. These optimized conditions allowed for the construction of branched and perfusable microvascular networks directly from patterned cells in as little as three days. These findings reveal important design principles for future microvascular engineering efforts based on bioprinting techniques.

Abstract Collagen cross-links created by the lysyl oxidase and lysyl hydroxylase families of enzymes are a significant contributing factor to the biomechanical strength and rigidity of tissues, which in turn influence cell signaling and ultimately cell phenotype. In the clinic, the proteolytically liberated N-terminal cross-linked peptide of collagen I (NTX) is used as a biomarker of bone and connective tissue turnover, which is altered in several disease processes. Despite the clinical utility of these collagen breakdown products, the majority of the cross-linked peptide species have not been identified in proteomic datasets. Here we evaluate several parameters for the preparation and identification of these peptides from the collagen I-rich Achilles tendon. Our refined approach involving chemical digestion for protein solubilization coupled with mass spectrometry allows for the identification of the NTX cross-links in a range of modification states. Based on the specificity of the enzymatic cross-linking reaction we utilized follow-up variable modification searches to facilitate identification with a wider range of analytical workflows. We then applied a spectral library approach to identify differences in collagen cross-links in bovine pulmonary hypertension. The presented method offers unique opportunities to understand extracellular matrix remodeling events in development, aging, wound healing, and fibrotic disease that modulate collagen architecture through lysyl-hydroxylase and lysyl-oxidase enzymes.

Collagen deposition and stromal stiffening accompany malignancy, compromise treatment, and promote tumor aggression. Clarifying the molecular nature of and the factors that regulate extracellular matrix stiffening in tumors should identify biomarkers to stratify patients for therapy and therapeutic interventions to improve outcome. We profiled lysyl hydroxylase- and lysyl oxidase-mediated collagen crosslinks and quantified the greatest abundance of total and complex collagen crosslinks in more aggressive human breast cancer subtypes with the stiffest stroma. These tissues also harbored the highest number of tumor-associated macrophages (TAM), whose therapeutic ablation not only reduced metastasis, but also concomitantly decreased accumulation of collagen crosslinks and stromal stiffening. Epithelial-targeted expression of the crosslinking enzyme lysyl oxidase had no impact on collagen crosslinking in PyMT mammary tumors, whereas stromal cell targeting did. Consistently, stromal cells in microdissected human tumors expressed the highest level of collagen crosslinking enzymes. Immunohistochemical analysis of a cohort of breast cancer patient biopsies revealed that stromal expression of lysyl hydroxylase two, an enzyme that induces hydroxylysine aldehyde-derived collagen crosslinks and stromal stiffening correlated significantly disease specific mortality. The findings link tissue inflammation, stromal cell-mediated collagen crosslinking and stiffening to tumor aggression and identify lysyl hydroxylase two as a novel stromal biomarker.

Summary Efforts to identify anti-cancer therapeutics and understand tumor-immune interactions are built with in vitro models that do not match the microenvironmental characteristics of human tissues. Using in vitro models which mimic the physical properties of healthy or cancerous tissues and a physiologically relevant culture medium, we demonstrate that the chemical and physical properties of the microenvironment regulate the composition and topology of the glycocalyx. Remarkably, we find that cancer and age-related changes in the physical properties of the microenvironment are sufficient to adjust immune surveillance via the topology of the glycocalyx, a previously unknown phenomenon observable only with a physiologically relevant culture medium. Key Points Culture medium dictates cellular mechanoresponse signatures in vitro Epithelial glycocalyx construction is mediated by Heat Shock Factor 1 (HSF1) Sialic acid topology dictates Natural Killer cell cytotoxicity Physiological microenvironments reveal distinct glycobiology