ABSTRACT How local interactions of actin regulators yield large-scale organization of cell shape and movement is not well understood. For example, why does the WAVE complex build lamellipodia, the broad sheet-like protrusions that power cell migration, whereas the homologous actin regulator N-WASP forms spiky finger-like actin networks? N-WASP is known to oligomerize into focal condensates that generate an actin finger. In contrast, the WAVE complex exhibits the linear distribution needed to generate an actin sheet. This linear organization of the WAVE complex could either arise from interactions with the actin cytoskeleton or could represent an ability of the complex to self-organize into a linear template. Using super-resolution microscopy, we find that the WAVE complex forms higher-order linear oligomers that curve into 270 nanometer-wide ring structures in the absence of actin polymer. These rings localize to the necks of membrane invaginations, which display saddle point geometries with positive curvature in one axis and negative curvature in the orthogonal axis. To investigate the molecular mechanism of saddle curvature enrichment, we show that the WAVE complex and IRSp53, a membrane curvature-sensitive protein, collaborate to recognize saddle curvature that IRSp53 cannot sense alone. This saddle preference for the WAVE complex could explain emergent cell behaviors, such as expanding and self-straightening lamellipodia as well as the ability of endothelial cells to recognize and seal transcellular holes. Our work highlights how partnering protein interactions enable complex shape sensing and how feedback between cell shape and actin regulators yields self-organized cell morphogenesis.

Membrane tension is thought to be a long-range integrator of cell physiology. This role necessitates effective tension transmission across the cell. However, the field remains strongly divided as to whether cell membranes support or resist tension propagation, in part due to a lack of adequate tools for locally manipulating membrane tension. We overcome these limitations by leveraging optogenetics to generate localized actinbased protrusions while concurrently monitoring the propagation of membrane tension using dual-trap optical tweezers. Surprisingly, actin-driven protrusions elicit rapid global membrane tension propagation with little to no attenuation, while forces applied to the cell membrane only do not. We present a simple unifying mechanical model in which mechanical forces that act on both the membrane and actin cortex drive rapid, robust membrane tension propagation. Summary Mechanical perturbations acting on both actin cortex and plasma membrane drive global membrane tension increase within seconds

ABSTRACT By acting both upstream and downstream of biochemical organizers of the cytoskeleton, physical forces function as central integrators of cell shape and movement. Here we use a combination of genetic, pharmacological, and optogenetic perturbations to probe the role of the conserved mechanoresponsive mTORC2 program in neutrophil polarity and motility. We find that the tension-based inhibition of leading edge signals (Rac, F-actin) that underlies protrusion competition is gated by the kinase-independent role of the complex, whereas the mTORC2 kinase arm is essential for regulation of Rho activity and Myosin II-based contraction at the trailing edge. Cells required mTORC2 for spatial and temporal coordination between the front and back polarity programs and persistent migration under confinement. mTORC2 is in a mechanosensory cascade, but membrane stretch did not suffice to stimulate mTORC2 unless the co-input PIP 3 was also present. Our work suggests that different signalling arms of mTORC2 regulate spatially and molecularly divergent cytoskeletal programs allowing efficient coordination of neutrophil shape and movement.

Abstract The ability to rapidly assemble and prototype cellular circuits is vital for biological research and its applications in biotechnology and medicine. Current methods that permit the assembly of DNA circuits in mammalian cells are laborious, slow, expensive and mostly not permissive of rapid prototyping of constructs. Here we present the Mammalian ToolKit (MTK), a Golden Gate-based cloning toolkit for fast, reproducible and versatile assembly of large DNA vectors and their implementation in mammalian models. The MTK consists of a curated library of characterized, modular parts that can be easily mixed and matched to combinatorially assemble one transcriptional unit with different characteristics, or a hierarchy of transcriptional units weaved into complex circuits. MTK renders many cell engineering operations facile, as showcased by our ability to use the toolkit to generate single-integration landing pads, to create and deliver libraries of protein variants and sgRNAs, and to iterate through Cas9-based prototype circuits. As a biological proof of concept, we used the MTK to successfully design and rapidly construct in mammalian cells a challenging multicistronic circuit encoding the Ebola virus (EBOV) replication complex. This construct provides a non-infectious biosafety level 2 (BSL2) cellular assay for exploring the transcription and replication steps of the EBOV viral life cycle in its host. Its construction also demonstrates how the MTK can enable important and time sensitive applications such as the rapid testing of pharmacological inhibitors of emerging BSL4 viruses that pose a major threat to human health.

ABSTRACT Optical pooled screening (OPS) is a highly scalable method for linking image-based phenotypes with cellular perturbations. However, it has thus far been restricted to relatively low-plex phenotypic readouts in cancer cell lines in culture, due to limitations associated with in situ sequencing (ISS) of perturbation barcodes. Here, we developed PerturbView, an OPS technology that leverages in vitro transcription (IVT) to amplify barcodes prior to ISS, enabling screens with highly multiplexed phenotypic readouts across diverse systems, including primary cells and tissues. We demonstrate PerturbView in iPSC-derived neurons, primary immune cells, and tumor tissue sections from animal models. In a screen of immune signaling pathways in primary bone marrow-derived macrophages, PerturbView uncovered both known and novel regulators of NFκB signaling. Furthermore, we combined PerturbView with spatial transcriptomics in tissue sections from a mouse xenograft model, paving the way to in vivo screens with rich optical and transcriptomic phenotypes. PerturbView broadens the scope of OPS to a wide range of models and applications.

To migrate efficiently, neutrophils must polarize their cytoskeletal regulators along a single axis of motion. This polarization process is thought to be mediated through local positive feedback that amplifies leading edge signals and global negative feedback that enables sites of positive feedback to compete for dominance. Though this two-component model efficiently establishes cell polarity, it has potential limitations, including a tendency to “lock” onto a particular direction, limiting the ability of cells to reorient. We use spatially-defined optogenetic control of a leading edge organizer (PI3K) to probe how cells balance “decisiveness” needed to polarize in a single direction with the flexibility needed to respond to new cues. Underlying this balancing act is a local Rac inhibitor that destabilizes the leading edge to promote exploration. We show that this local inhibitor enables cells to process input signal dynamics, linking front stability and orientation to local temporal increases in input signals.

Migratory cells use distinct motility modes to navigate different microenvironments, but it is unclear whether these modes rely on the same core set of polarity components. To investigate this, we disrupted Arp2/3 and WAVE complex, which assemble branched actin networks that are essential for neutrophil polarity and motility in standard adherent conditions. Surprisingly, confinement rescues polarity and movement of neutrophils lacking these components, revealing a processive bleb-based protrusion program that is mechanistically distinct from the branched actin-based protrusion program but shares some of the same core components and underlying molecular logic. We further find that the restriction of protrusion growth to one site does not always respond to membrane tension directly, as previously thought, but may rely on closely linked properties such as local membrane curvature. Our work reveals a hidden circuit for neutrophil polarity and indicates that cells have distinct molecular mechanisms for polarization that dominate in different microenvironments.

Although the primary protein sequence of ubiquitin (Ub) is extremely stable over evolutionary time, it is highly tolerant to mutation during selection experiments performed in the laboratory. We have proposed that this discrepancy results from the difference between fitness under laboratory culture conditions and the selective pressures in changing environments over evolutionary time scales. Building on our previous work (Mavor et al. 2016), we used deep mutational scanning to determine how twelve new chemicals reveal novel mutational sensitivities of ubiquitin residues. We found sensitization of Lys63 in eight new conditions. In total, our experiments have uncovered a highly sensitizing condition for every position in Ub except Ser57 and Gln62. By determining the Ubiquitin fitness landscape under different chemical constraints, our work helps to resolve the inconsistencies between deep mutational scanning experiments and sequence conservation over evolutionary timescales.